[发明专利]一种近红外固态发光的荧光探针及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种近红外固态发光的荧光探针及其制备方法与应用，其结构式如式Ⅰ所示：本发明式Ⅰ结构所示荧光探针具有固态近红外发光性质，能够有效降低背景荧光信号，减少生物体自体荧光干扰，提高探针的灵敏度；其对谷氨酰转肽酶的响应快速，30min内能够响应饱和。本发明式Ⅰ结构所示荧光探针对谷氨酰转肽酶的选择性好；本发明式Ⅰ结构所示荧光探针对活细胞染色效果很好，染色时间较短，染色效率高，能够实现细胞膜表面谷氨酰转肽酶的原位检测；本发明式Ⅰ结构所示荧光探针光稳定性好，在活细胞成像中荧光信号稳定，不扩散。

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种近红外固态发光的荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

细胞膜表面的蛋白酶活性对细胞的生长、分化以及细胞间的交流都有着极其重要的作用，然而目前能用于细胞膜表面蛋白酶的原位成像手段依然有很大的局限性。过去的几十年中，小分子荧光探针已经广泛应用于生物目标物的检测和成像。然而，已有的荧光探针大多是基于脂溶性染料设计的，由于细胞膜具有两亲性的特点，探针在细胞膜经过酶水解后释放的染料很容易进入细胞内，从而呈现假信号，失去酶活性的原位成像信息。

固态荧光团因其极差的水溶性，目前已经实现了一部分生物标记物的原位成像。然而其本身激发和发射波长较短，在进行生物成像的时候存在背景荧光的干扰，另一方面其本身具有一定的脂溶性，不适合用于细胞膜表面相关酶的原位成像。因此，开发一种具有强疏水性，弱脂溶性和近红外荧光的固态荧光团用于细胞膜表面相关酶的原位成像具有极其重要的意义。

谷氨酰转肽酶(GGT)是一种细胞膜锚定的胞外酶，主要负责将细胞外的谷胱甘肽转化为半胱氨酸用来维持细胞正常的氧化还原平衡。在肿瘤，炎症等多种疾病中，GGT活性均有明显提高。因此，在细胞膜表面长时原位的成像膜表面相关蛋白酶对于研究疾病的发生，发展和治疗都有着非常重要的意义，然而，目前并没有一个有效的检测成像手段可以实现细胞膜表面GGT的原位成像。

发明内容

本发明的目的是提供一种弱脂溶性，强疏水性近红外固态发光的荧光探针及其制备方法与应用；可以解决传统荧光探针在细胞成像过程中容易扩散造成假阳性信号的问题，提高荧光成像对比度的技术问题。

本发明这种近红外固态发光的荧光探针，其结构式如式Ⅰ所示：

本发明这种近红外固态发光的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将化合物1和乌洛托品溶于三氟乙酸中，加热条件下进行回流反应，反应结束后，加入盐酸进行水解反应，反应结束后，过柱分离后，得到黄色中间体化合物2；

(2)将步骤(1)中的化合物2与2-氨基-5-氯苯甲酰胺及对甲苯磺酸在无水乙醇溶剂中进行回流反应，反应结束并冷却后，向其中加入二氯二氰基苯醌，然后抽滤，得到红色的固体，用乙醇洗涤固体，烘干即得固态荧光染料HYPQ；

(3)将化合物3溶于二氯甲烷中，在冰浴条件下加入DCC，进行初级反应，反应结束后，接着加入2-甲氨基哌啶，并渐渐升温至室温，进行反应，反应完毕后，抽滤掉生成的固体，滤液旋干，饱和碳酸氢钠水溶液洗，二氯甲烷萃取，再调节pH到2～4，产物在水中，再将pH调到11～13，二氯甲烷萃取，旋干，泵0.5～2h，得到化合物4；

(4)在氮气保护下，将步骤(2)中HYPQ溶于无水二氯甲烷和二甲亚砜中，在冰浴条件下中，加入DIPEA，并搅拌混匀，接着加入三光气，常温下搅拌反应，反应完毕后，真空泵抽出未反应的光气；化合物4溶于无水二氯甲烷后加入反应体系，接着加入DIPEA继续反应，反应完毕后，将反应液进行萃取收集有机相，有机相干燥后减压旋蒸去掉萃取溶剂，得到粗产物化合物5，用二氯甲烷重新溶解化合物5，接着向其中加入三氟乙酸脱保护基，刮板提纯产物，得到式Ⅰ所示的近红外固态发光的荧光探针；

合成路线如下：