[发明专利]一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用

权利要求书

1.一种冠状病毒假病毒包装系统，其特征在于：包括改良型水泡性口炎病毒VSV、表达C端修饰优化的COVID-19刺突蛋白S的装配细胞，冠状病毒为COVID-19病毒，所述刺突蛋白S的氨基酸序列为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7；所述改良型水泡性口炎病毒VSV定义为携带Fluc-EGFP双报告基因置换结构基因的复制缺陷病毒，命名为dVSVΔG-Fluc-EGFP；所述VSV的遗传物质中编码GP的基因被Fluc报告基因置换，EGFP报告基因整合在Fluc与VSV聚合酶L基因之间，所述dVSVΔG-Fluc-EGFP的基因序列为SEQ ID NO：3所示，SEQ ID NO：3基因序列结构可使Fluc与EGFP报告基因同时高效表达；

所述装配细胞选自293、293T、293sus、HEK293、HEK293T、HEK293FT、BHK或Vero，所述装配细胞瞬时或诱导表达C端修饰优化的COVID-19刺突蛋白S，所述瞬时表达通过真核表达载体转染细胞实现，所述诱导表达通过四环素调控tet-on/off的慢病毒载体系统转导细胞实现；

所述C端修饰优化的COVID-19刺突蛋白S的表达为瞬时表达质粒pCAGGS介导或tet-on/off诱导表达慢病毒载体FG-TRE介导；所述C端修饰优化的COVID-19刺突蛋白S选自S基因的3’端16aa～28aa的截短体且与HA短肽序列融合，氨基酸序列为SEQ ID NO：7，将dVSVΔG-Fluc-EGFP、表达COVID-19刺突蛋白S的装配细胞一步混合，一定时间后收集上清液获得COVID-19假病毒。

2.一种如权利要求1所述的冠状病毒假病毒包装系统的一步法包装方法，所述一步法包装方法，具体实施步骤如下：

(1)在瞬时或稳定或诱导表达VSV包膜蛋白GP的293T细胞中加入dVSVΔG-Fluc-EGFP，24h后收集上清即可得到扩增后的VSV复制缺陷病毒，测定其滴度；

(2)将瞬时或稳定或诱导表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞293T传代至60mmdish中，加入dVSVΔG-Fluc-EGFP，其中感染复数MOI＝0.1～5，置于32℃～37℃培养箱中培养，24h后收获假病毒上清液，再加入抗VSV的中和抗体处理2h，用0.22um滤膜过滤后即可得到冠状病毒假病毒。

3.一种如权利要求1中所述冠状病毒假病毒包装系统在制备生物指示剂中的应用，其特征在于：所述生物指示剂由冠状病毒假病毒包装系统包装出的冠状病毒假病毒替代野生型冠状病毒应用于抑制及消杀冠状病毒的生物、化学物质及物理处理方法效力的检测和评价，所述抑制及消杀冠状病毒的物质与方法包括抗冠状病毒中和抗体及大分子、小分子药物、物理消毒杀菌方法、化学消毒杀菌剂。

4.如权利要求1所述的冠状病毒假病毒包装系统包装出的冠状病毒假病毒在评估消杀剂效力中的应用，步骤如下：

(1)病毒污染环境搭建

通过病毒污染分布模型分析，模拟消杀剂评估场景下目的病毒分布情况，包括存在介质、温度、湿度、气体扰动情况；

将包装得到的冠状病毒假病毒稀释后均匀涂抹在介质上，并设置好评估场景的环境参数；

(2)消杀处理前冠状病毒假病毒浓度测定

根据评价需要，通过取样不同位置、不同点数的冠状病毒假病毒进行处理前标准病毒特性检测；

(3)消杀作用过程中及作用后取样测定

将消毒杀菌剂均匀喷洒或涂抹在介质上；

根据评价需要，选取步骤(2)所选定位置、点数，在不同时刻对冠状病毒假病毒进行取样，并进行冠状病毒假病毒滴度活性检测。

5.权利要求4所述冠状病毒假病毒包装系统包装出的冠状病毒假病毒在评估消杀剂效力中的应用，其特征在于：步骤(1)中的病毒污染环境包括物流环境、居家环境、公共场所环境、学校。