[发明专利]一种高丝氨酸生物传感器及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种高丝氨酸生物传感器，其是基于谷氨酸棒状杆菌转录调节因子NCgl0581构建的，含有NCgl0581开放阅读框和NCgl0580启动子的基因组区域被克隆在GFP的前面，使得GFP的表达受NCgl0580启动子的控制。本发明传感器将L‑高丝氨酸浓度与荧光信号强度联系起来，使L‑高丝氨酸浓度可视化，实现对目标产物L‑高丝氨酸的灵敏检测。该生物传感器可在0~5g/L的L‑高丝氨酸浓度下表现良好的线性关系。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生物传感器及其构建方法，和在筛选氨基酸高产菌株中的应用。

背景技术

L-高丝氨酸是一种天然存在的重要功能性氨基酸，是甲硫氨酸、赖氨酸和苏氨酸的前体，参与体内多种生理生化反应和多个生物代谢过程，具有重要的生理功能和应用价值。L-高丝氨酸作为中间体或原料合成多种化工产品、农药及饲料，广泛应用于食品、化妆品、医药和饲料等领域，具有广阔的应用前景。例如，L-高丝氨酸是用来合成新型农药L-草胺磷的主要前体原料，已在国外发达国家得到广泛应用，且需求量逐年递增。

目前，高丝氨酸的合成方法主要是化学法和生物酶法。化学法以L-甲硫氨酸或天冬氨酸为原料，需要使用碘化物和大量有机溶剂，并且生成硫化物，对环境造成污染。生物酶法是以丙酮酸和醛类化合物为原料，在醛缩酶、甲酸脱氢酶和L-氨基酸脱氢酶复合酶的共同催化下反应得到高丝氨酸，成本高，需要使用有毒原料甲醛和甲酸，并需要使用价格昂贵的辅酶等。微生物发酵法具有成本低、条件温和、环境污染少等许多优点，近年来已成为生产各类氨基酸的首选工艺。

生物传感器已广泛应用于多种氨基酸高产菌株的途径优化和高效筛选。代谢物生物传感器是基于转录调控因子、RNA 开关等生物识别元件和荧光信号、酶活力等信号输出元件构建的一类生物传感器装置，能够感应细胞内特定代谢物浓度的变化，转化为可识别信号输出，在构建高效微生物细胞工厂中具有巨大应用潜力。通过后续偶联高通量筛选装置建立相应的小分子代谢物筛选技术，可以为快速筛选获得性能优异的菌种资源提供重要保障。然而目前为止，尚没有关于L-高丝氨酸生物传感器的报道。由于缺乏简便快捷的检测方法，极大地限制了L-高丝氨酸高产菌株的高通量筛选和选育。本发明通过设计和构建基于转录调控因子的L-高丝氨酸生物传感器，并将其偶联流式细胞分选等高通量筛选体系，可以高效快速的筛选出L-高丝氨酸高产候选菌。

发明内容

本发明目的在于提供一种L-高丝氨酸生物传感器及其构建方法，并使用该生物传感器建立高效的L-高丝氨酸高产菌株筛选方法。

本发明依据L-高丝氨酸结构特性分析，选择能够响应结构相似的丝氨酸的转录调控因子为候选元件，首选提供了一种基于转录调控因子NCgl0581的L-高丝氨酸生物传感器的构建方法，该生物传感器可以将L-高丝氨酸浓度转化为荧光强度信号。所述生物传感器是由谷氨酸棒杆菌来源的转录调控因子NCgl0581编码基因、NCgl0581启动子区、NCgl0580启动子区、标记基因和质粒骨架组成。本发明提供的生物传感器能特异性响应L-高丝氨酸，在0~5 g/L L-高丝氨酸浓度下表现出优良的线性关系。

因此，本发明首先提供一种L-高丝氨酸生物传感器，其是含有NCgl0581启动子及与其可操作连接的NCgl0581开放阅读框，和NCgl0580启动子及与其可操作连接荧光蛋白GFP基因的表达载体。

优选地，所述转录调控因子NCgl0581编码基因来源于谷氨酸棒杆菌，和/或基因NCgl0580的启动子区域来源于谷氨酸棒杆菌。

在一个具体实施方案中，所述标记基因优选为编码绿色荧光蛋白的GFP基因。

在具体实施方式中，所述表达载体适合于在大肠杆菌、或谷氨酸棒杆菌中表达。更优选地，所述表达载体为大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pTRCmob表达质粒。