[发明专利]新型冠状病毒灭活疫苗中新型冠状病毒S蛋白含量的检测方法

说明书

本发明提供新型冠状病毒灭活疫苗中新型冠状病毒S蛋白含量的检测方法。该检测方法利用了本发明的定量肽段(GWIFGTTLDSK)；定量肽段的离子对中母离子的质荷比为612.8161，子离子的质荷比为244.1080和/或216.1080。利用该定量肽段和定量离子对，通过高效液相色谱串联质谱定量检测方法，S蛋白标准品制作标准曲线，将待测新冠病毒疫苗孵育酶解后进行定量检测，得到样品中定量肽段的子离子峰面积，进而计算得到样品中新型冠状病毒S蛋白的含量。该方法检测准确率高，精确度高，避免了疫苗样品中基质效应等对检测的影响，能够用于新冠病毒灭活疫苗各阶段中间产品及成品的新冠病毒S蛋白含量检测。

技术领域

本发明属于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)灭活疫苗检测技术领域，涉及新型冠状病毒灭活疫苗中新型冠状病毒S蛋白含量的检测方法，尤其涉及利用液相色谱串联质谱定量检测新型冠状病毒灭活疫苗中新型冠状病毒S蛋白含量的方法。

背景技术

2019年底发现的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)疫情迅速席卷全球，对全球各地区人民的生命健康和社会的经济发展都带来巨大的损失。SARS-CoV-2病毒直径在为60～140nm，主要有4种结构蛋白，分别为S(棘突)蛋白、N(核衣壳)蛋白、M(膜)蛋白、E(包膜)蛋白。其中，S蛋白是病毒最重要的表面膜蛋白，也是引起免疫应答的重要抗原，是疫苗设计的关键靶点。疫苗作为狙击和预防新冠病毒的一种有效方式，成为全球药物研发的关注焦点。灭活疫苗是针对新发突发传染病最有效的疫苗研发途径。具有生产工艺成熟、质量标准可控、保护范围广等优点，可用于大规模接种，并且有国际通行标准来判断疫苗的安全性和有效性。灭活疫苗中有效抗原含量的检测尤为关键。

灭活疫苗是针对新发突发传染病最有效的疫苗研发途径。具有生产工艺成熟、质量标准可控、保护范围广等优点，可用于大规模接种，并且有国际通行标准来判断疫苗的安全性和有效性。灭活疫苗中有效抗原含量的检测，如新冠病毒中S蛋白和N蛋白的含量测定，对于疫苗评价有着十分重要的意义。

传统方法检测灭活疫苗中新型冠状病毒S蛋白含量需要依靠免疫学分析方法，如双抗体夹心酶联免疫法检测。采用酶联免疫技术检测新型冠状病毒中的S蛋白，利用重组表达S蛋白抗原，通过基础免疫和加强免疫小鼠或家兔，制备单克隆或多克隆抗体。将纯化后抗S蛋白抗体包被固相载体如酶联反应板，封闭干板后，加入待测产品，进行孵育洗板操作后，加入酶标记的抗S蛋白抗体，形成标记后的免疫复合物，通过洗涤，将未被结合的酶结合物以及其它物质去除。通过显色或者发光等方式对标记物进行检测，通过标准曲线可以定量检测待测产品中SARS-CoV-2的S蛋白含量。利用酶联法检测S蛋白的技术需要大量时间通过动物免疫过程制备特异性抗体，且对抗体质量要求较高，不仅需要极高的特异性，而且抗体一般需要较高的亲和力。酶联免疫实验在检测过程中易受检测样本中其它成分干扰影响测定结果，造成定量不准确。酶联免疫技术实验操作过程复杂，需要进行3～5步骤孵育和酶联反应板洗涤操作，人为因素对实验影响较大，而且去反应过程易受环境因素影响，故其稳定性和重复性较差。由于酶联免疫法线性范围较窄，一般为10²，对于未知浓度样品需要进行预实验或样品稀释，才能将样品落在最佳线性范围内得到准确测定，而过多的稀释过程一般会造成的样品检测的不准确。

近年来，液相色谱串联质谱技术在蛋白质的检测分析方面具有高选择性和高灵敏度等优点，非常适用于复杂生物基质中靶向蛋白质的定性和定量研究。

发明内容