[发明专利]新型冠状病毒灭活疫苗中新型冠状病毒S蛋白含量的检测方法

权利要求书

1.一种用于液相色谱串联质谱定量检测新型冠状病毒S蛋白的定量肽段，其氨基酸序列如下：

GWIFGTTLDSK(SEQ ID NO：1)。

2.根据权利要求1所述的定量肽段，其中，所述定量肽段的定量离子对中母离子的质荷比为612.8161，子离子的质荷比为244.1080和/或216.1080。

3.权利要求1或2所述定量肽段在液相色谱串联质谱定量检测新型冠状病毒S蛋白中的应用。

4.一种新型冠状病毒灭活疫苗中新型冠状病毒S蛋白含量的检测方法，其包括以下步骤：

对重组新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白标准品进行孵育并进行酶解处理；采用高效液相色谱串联三重四级杆质谱分析检测设备，进样酶解处理后的重组新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白标准品，以标准品含量为横坐标，以权利要求1或2所述的定量肽段的子离子峰面积为纵坐标绘制标准曲线；

取待测新型冠状病毒SARS-CoV-2的灭活疫苗样品进行孵育并进行酶解处理；将酶解后的上清液进样检测，根据所述定量肽段的子离子峰面积，基于标准曲线和进样体积获得待测的灭活疫苗样品中新型冠状病毒SARS-CoV-2的定量肽段的含量，除以进样体积，即得到待测的灭活疫苗样品中新型冠状病毒S蛋白的浓度。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其中，重组新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白标准品或待测新型冠状病毒SARS-CoV-2的灭活疫苗样品进行孵育的过程包括：

向重组新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白标准品或待测的灭活疫苗样品中等体积加入RapiGEST，于70～90℃条件下孵育20～60min后，接着加入二硫苏糖醇至终浓度为25mmol/L，于65℃条件下孵育60min，温度降至室温后加入碘代乙酰胺溶液至终浓度为50mmol/L，避光室温孵育20～60min。

6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其中，孵育后进行酶解处理的过程包括：

向220μL孵育后的重组新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白标准品或孵育后的待测的灭活疫苗样品中加入NH₄HCO₃溶液至体积为480μL，接着加入胰蛋白酶溶液20μL，于37℃条件下过夜酶解，酶解反应完成后，加入1μL的甲酸以使胰蛋白酶失活，即结束酶解反应。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其中，重组新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白标准品或待测新型冠状病毒SARS-CoV-2的灭活疫苗样品的高效液相色谱检测条件如下：

色谱柱：C18柱，优选选用ACQUITY UPLC PEPTIDE BEH C18(2.1mm×100mm)，进样量为5～10μL，色谱柱温度为60℃；

流动相组成：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈溶液；流动相B在0～20min内含量从0～45％变化进行梯度洗脱，流速为0.3mL/min。

8.根据权利要求4所述的检测方法，其中，重组新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白标准品或待测新型冠状病毒SARS-CoV-2的灭活疫苗样品的质谱检测条件如下：

离子源参数：雾化器流量3.0L/min，干燥器流量10.0L/min，接口温度300℃，脱溶剂气温度526℃，电喷雾电压3.0kV；DL温度250℃。

9.根据权利要求4或8所述的检测方法，其中，母离子质荷比为612.8161、子离子质荷比为244.1080的定量离子对的Q1 Pre偏差(v)-20.0；CE＝-20；Q3 Pre偏差(v)-17.0。

10.根据权利要求4或8所述的检测方法，其中，母离子质荷比为612.8161、子离子质荷比为216.1080的定量离子对的Q1 Pre偏差(v)-15.0；CE＝-24；Q3 Pre偏差(v)-15.0。