[发明专利]一种构建四肢畸形小鼠模型的方法

说明书

本发明提供了一种构建四肢畸形小鼠模型的方法，利用条件性基因打靶Cre/LoxP系统，将Hnrnpk基因两侧带有同向LoxP位点的标记小鼠，与在组织特异性Prx1的增强子控制下表达Cre重组酶的Prx1‑Cre小鼠进行杂交，筛选，获得四肢畸形小鼠模型；所述两个同向的LoxP位点分别位于Hnrnpk基因的4～7号外显子两侧，以Hnrnpk基因的4～7号外显子作为敲除区域。本发明四肢畸形的小鼠模型的构建方法简便、经济，在筛选治疗四肢畸形药物的中具有极大的前景。

技术领域

本发明涉及动物模型技术领域，具体涉及一种构建四肢畸形小鼠模型的方法。

背景技术

据统计，四肢畸形是人类第二大常见的先天性畸形疾病，约占出生缺陷疾病的2％，该类疾病的病理基础来源于胚胎时期肢芽发育出现了异常改变，然而肢芽发育过程中的具体分子调控机制尚未完全阐明。肢芽发育的早期(胚胎期11.5之前)是以间充质细胞的增殖为主，而该过程发生异常则会导致肢体出现缺失、少趾等常见疾病的发生。

脊椎动物四肢骨骼起源于胚胎的侧板中胚层，胚胎肢芽(Limb bud)开始出现于人胚胎发育的26天左右和小鼠E9.5左右。肢芽细胞来自于中胚层的间质细胞，是一类多能干细胞，称为间质祖细胞(MPCs)。肢芽出现后，肢芽内的MPCs开始增殖、聚集、逐渐分化形成软骨原基，随后软骨细胞经历增殖、肥大、血管入侵及骨化形成骨，这些MPCs也被称为骨软骨祖细胞或骨骼干细胞。在此过程中，MPCs的增殖和存活是四肢骨发育的始动和核心环节。研究表明，肢体的大小由MPCs的数量，以及控制MPCs的外部信号决定，而MPCs的数量取决于调控细胞增殖与凋亡平衡的分子网络。在肢芽发育早期(小鼠E9.5-E11.5)，未分化的MPCs被外胚层覆盖，表达FGF10，诱导外胚层增厚形成顶端外胚层嵴(Apical Ectodermal Ridge，AER)，AER区反之分泌FGF8、FGF2、BMP-2、BMP-4、MSX2和MSX2，启动MPCs的增殖。在肢芽的后缘，会形成极化区(Zone of Polarizing Activity,ZPA)，该ZPA区通过分泌Sonichedgehog(Shh)和BMP4调控肢体前后轴(拇指到小指轴)的发育。Shh被证明通过刺激MPCs增殖和调节顶端外胚层脊的前后长度来控制肢芽的宽度。除了这些调控细胞增殖的分子，凋亡调控分子p19,p21和RIP5也发现在AER区及AER外间质区表达，说明这些分子在调控肢芽细胞的凋亡中扮演重要角色。细胞周期抑制因子p21缺陷小鼠已证明出现MPCs的增殖抑制。在小鼠E12.5的时候，增殖的MPCs聚集，表达BMP和Sox9等信号分子/转录因子启动MPCs的成软骨分化，形成软骨原基。此外Wnt、Notch信号分子、Hox转录调控分子等家族成员之间相互作用的复杂网络在调控MPCs的增殖及转归中也十分重要。这些调控MPCs命运的关键因子的功能缺失或调控失衡均可影响随后的软骨内骨化导致四肢发育畸形。然而调控MPCs的分子机制非常复杂，仍然有许多参与调控的蛋白未被发现和证明。

hnRNPK首次发现于hnRNP复合物，是进化上高度保守的蛋白质，HNRNPK基因位于人9q21.32。hnRNPK含有3个KH结构域，其中相邻的2个KH结构域，KH1和KH2位于氨基端，而KH3位于羧基端16；此外，hnRNPK还含有一个核定位信号、核穿梭结构域17。通过这些结构域，hnRNPK可与RNA和DNA结合发挥多种功能。研究表明hnRNPK可以作为转录因子，参与基因表达的转录调控过程；同时hnRNPK可通过KH基序与核酸结合介导mRNA稳定性、剪接和翻译，hnRNPK还可以稳定染色质的结构。通过这些功能hnRNPK参与了细胞的周期调控、增殖、凋亡和分化。hnRNPK对于胚胎形成和发育至关重要，其等位基因的完全缺失将导致小鼠胚胎死于E13.5之前，单倍体剂量不足将导致部分新生致死以及新生小鼠的发育缺陷。