[发明专利]一种利用浮萍表达系统制备草鱼呼肠孤病毒口服亚单位疫苗的方法

说明书

本发明公开了一种利用浮萍表达系统制备草鱼呼肠孤病毒口服亚单位疫苗的方法。本发明能够利用浮萍表达系统简便、高效表达草鱼呼肠孤病毒口服亚单位疫苗，本方法包括外源基因的扩增、农杆菌植物双元表达载体的构建、浮萍愈伤组织遗传转化体系的建立，并使用PCR、荧光显微观察、GUS染色和Western blotting等实验技术验证外源基因的表达。本发明能利用浮萍高效表达草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗，制备的疫苗可直接口服免疫草鱼，可减少因草鱼呼肠孤病毒感染而造成的经济损失，也便于操作，节省成本，更具有推广和实际应用价值。

技术领域

本发明属于草鱼呼肠孤病毒口服亚单位疫苗的制备技术领域，具体涉及一种利用浮萍表达系统制备草鱼呼肠孤病毒口服亚单位疫苗的方法。

背景技术

草鱼是我国淡水渔业中重要的养殖品种之一，我国每年的草鱼总产量约占国内淡水鱼类养殖总产量的25%左右，占世界草鱼养殖总产量的90%以上。但是，草鱼抵抗病原能力较差，在生长的各个阶段均易遭受疾病侵袭，其中草鱼出血病是严重制约草鱼养殖业可持续发展的主要障碍。草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）是引起草鱼出血病的病原，该疾病流行地区广泛，发病率高，死亡率高达90%以上，是草鱼健康养殖中的瓶颈问题。

科学使用疫苗是预防该病最有效的手段，其中，口服疫苗由于操作简单，且能够减少对鱼类的机械损伤和应激，受到国内外研究者的广泛关注。但是，口服疫苗易受胃肠道内消化酶的降解，因此，可有效避免口服疫苗被降解和消化的疫苗递送系统是口服疫苗发挥作用的基础和保障。植物真核表达系统在蛋白表达过程中的修饰和加工更加完善，且在一定程度上可减少消化道对疫苗的破坏，所以，植物作为口服疫苗的生产和递送系统成为研究的热点。其中，浮萍作为单子叶水生漂浮植物，因繁殖速度快，蛋白表达量高等优势备受青睐。利用浮萍表达系统制备草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗，抗原免疫原性更高，同时浮萍的细胞壁属于天然的“生物胶囊”，作为递送系统可减少胃肠道对疫苗的降解。此外，利用浮萍制备的草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗，可直接饲喂草鱼，操作方便，价格低廉，更适于应用和推广。近些年来，浮萍在作为植物生物反应器和递送系统等研究方面取得了令人瞩目的进展，但是，国内外尚无利用浮萍表达系统制备草鱼出血病口服亚单位疫苗的相关报道。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种利用浮萍表达系统制备草鱼呼肠孤病毒口服亚单位疫苗的方法。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种利用浮萍表达系统制备草鱼呼肠孤病毒口服亚单位疫苗的方法，其特征在于具体过程为：

步骤S1：将Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒培养于L8824细胞系中，培养后收集细胞培养液，离心取上清提取病毒RNA，通过反转录获得cDNA模板，根据GenBank中提交的S11序列设计引物，使用PCR扩增技术获得S11基因，随后将扩增的S11基因片段构建到pCAMBIA1303载体中，再进行双酶切和测序验证；

步骤S2：将验证正确的重组质粒pCAMBIA1303-S11与农杆菌EHA105感受态细胞混匀，冰浴后放入液氮中速冻1 min，然后在37℃水浴中放置5 min，接着冰浴2 min，然后加入1 mL YEP液体培养基，28℃、160 rpm振荡培养4 h，然后均匀涂布到含卡那霉素的LB固体培养基上，挑选单克隆进行PCR检测，阳性菌保存于15wt%甘油并放置在-80℃保藏备用；

步骤S3：将转有重组质粒的土壤农杆菌EHA105在50 mL YEP液体培养基中复苏摇菌至OD为0.5-0.8，离心后使用B5培养基重悬，加入乙酰丁香酮和吐温，混匀活化农杆菌，然后将脱菌的深绿色结实紧密的稀脉萍胚性愈伤块移入农杆菌悬浮液中，培养30 min后使用滤纸吸干愈伤组织表面的菌液，然后将愈伤组织转移到B5培养基中暗培养两天，待淡色的菌圈出现时，超声波清洗愈伤组织后使用筛选培养基筛选13-16 d，当愈伤组织达到5-6 mm移入再生培养基培养28-32 d获得再生植株。