[发明专利]组氨酸缓冲液在减少蛋白聚体中的应用

说明书

本发明属于药物蛋白检测技术领域，具体涉及组氨酸缓冲液在减少蛋白聚体中的应用。所述的组氨酸缓冲液包含重量比为15/192‑116/53的L‑组氨酸和组氨酸盐。所述的组氨酸缓冲液不仅能使氨基酸序列的C端连接有纳米抗体的蛋白质变得稳定，在涡旋的过程中不会额外产生聚体，保证了样品检测结果的客观性和准确性；还可作为稀释液代替流动相来稀释样品，不会干扰样品的出峰；同时减少了不同人之间由于操作差异可能导致的实验误差，使SEC检测方法的操作步骤简单化，适用于氨基酸序列的C端连接有纳米抗体的蛋白质的SEC检测。

技术领域

本发明涉及药物蛋白检测技术领域，具体涉及组氨酸缓冲液在减少蛋白聚体中的应用。

背景技术

由于抗体药物蛋白质大多数由CHO细胞表达，糖基化程度高，在细胞培养和纯化生产工艺流程中会聚集产生多聚体，多聚体具备免疫原性。因此在治疗性蛋白药物中，聚体通常被认为影响药效甚至引起免疫原性，而被作为产品相关杂质，需在下游纯化工艺中被去除。体积排阻色谱法（size exclusion chromatography, SEC）作为一种监测聚体含量的不可或缺的方法，被广泛运用于治疗性蛋白药物的聚体含量测定中。在治疗性蛋白药物的研发、生产及储存过程中，SEC检测方法的检测结果直接关系了下游工艺的开发，产品的放行以及产品的稳定性等。

在SEC的日常检测中，当样品浓度过高或为了防止吐温80积累造成的干扰，待测样品往往需要被流动相稀释后再进样分析。但在实际的检测过程中发现以下问题：通常在蛋白氨基酸序列C端带有纳米抗体（Nanobody）的双特异性抗体在用流动相稀释时，其对涡旋的耐受性较差，涡旋后的双特异性抗体（C端带Nanobody）聚体明显增多，并且随着涡旋时间的延长，聚体含量逐渐增高。这种人为产生的聚体严重干扰了SEC检测结果的客观性和准确性，为避免这种现象的发生，通常的样品稀释方法是控制涡旋时间，包括如下步骤：取400µg样品，用流动相稀释至2mg/mL；将稀释后的样品置于涡旋仪上涡旋3秒；将涡旋后的样品微离心。上述样品稀释方法存在以下缺点：1.仍然有少量的人为聚体在涡旋中产生；2.较短的涡旋时间无法保证样品与流动相充分混匀，即无法保证样品的均一性；3.为严格控制涡旋时间，需用计时器读秒，而这种方式增加了方法的繁琐性；4.涡旋的时间较短，难以控制，不同人操作的误差大，导致SEC检测结果的误差也大；5.只控制了涡旋时间，但涡旋的振荡频率和幅度难以控制。

因此，需要研发一种稳定、准确的SEC检测方法，减少双特异性抗体（C端带Nanobody）在涡旋过程中产生的聚体，这对于治疗性蛋白药物的检测显得尤为重要。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种组氨酸缓冲液，能使氨基酸序列的C端连接有纳米抗体的蛋白质变得稳定，在涡旋的过程中不会额外产生聚体，保证了样品检测结果的客观性和准确性，且不会干扰样品的出峰，简化SEC检测的操作步骤，适用于氨基酸序列的C端连接有纳米抗体的蛋白质的SEC检测。

为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

本发明发现：组氨酸缓冲液（包含组氨酸和组氨酸盐）能起到抗氧化的作用，防止蛋白质被氧化形成聚体或碎片；还能与蛋白的疏水区域结合，促进蛋白的溶解性，从而防止蛋白聚集形成聚体。

因此，首先，本发明提供了组氨酸缓冲液在保护蛋白质方面的应用。

具体地，所述的应用指组氨酸缓冲液与蛋白质混合后，而减少蛋白质聚集体。

更具体地，所述的应用指组氨酸缓冲液与蛋白质混合后，进行物理性、化学性、生物性操作时，减少蛋白质聚集体。

更具体地，所述的物理性操作指震荡、摇匀、涡旋、离心、加热、加压、脱水、冷冻、超声波和/或紫外线照射。

更具体地，所述的化学性操作指强酸、强碱、尿素、乙醇、丙酮、无机盐、有机盐、重金属盐和/或SDS处理。