[发明专利]一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法及其应用

说明书

本发明属于精子检测技术领域，尤其涉及一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法及其应用。本发明创造性地使用可移动的微型激发光探头，将其定位到单个精子附近，并构建了完整的检测流程，包括：处理、定位、降噪、测量、基线处理等步骤。最终实现了对单个精子的散发荧光强度进行精确定量，并且可以准确地给出精子胞内活性氧数值；本发明是领域内首创的单个精子水平的活性氧检测，填补了领域空白，而且本发明对精子数目没有限制，能适用于包括重度少精子症在内的几乎所有患者。

技术领域

本发明属于精子检测技术领域，尤其涉及一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法及其应用。

背景技术

活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是指存在于所有生活在含氧环境中的生物体的不稳定的、化学性质活泼的、氧化能力很强的氧衍生物。这些氧衍生物是正常代谢过程中的副产物，它们包括超氧阴离子(O2·-)、过氧化氢(H2O2)、氢氧基(·OH)、氢过氧自由基(HO2)、过氧化脂质(ROOH)等。研究发现，生物体产生的过量ROS和抗氧化防御系统之间的失衡会导致氧化应激，氧化应激在很多病理过程中都起着重要作用，包括男性不育。

由男方原因造成的不育称为男性不育，约占男女不育因素的50％。并且，大约30％-50％的男性不育确切病因不明，被称为特发性男性不育，最近文献表明，30％-80％的不育男性精液中的活性氧水平升高，高水平的活性氧引起的氧化应激会导致精子膜脂质过氧化损伤、精子DNA损伤、精子线粒体损伤及细胞凋亡，从而破坏精子活性和功能，包括对精子的发生、前向运动、获能、顶体反应、受精等多环节产生不同程度的影响，进而损害男性生育能力。因此，活性氧对于男性不育和人类生殖有重要影响。有学者提出，在特发性男性不育症患者中若发现精液或精子中活性氧指标升高，可以诊断为男性氧化应激性不育。因此检测男性精液和精子中活性氧水平是诊断男性不育和评估男性不育治疗疗效的重要指标之一。

目前，化学发光法和荧光探针法由于具有操作简便、反应灵敏、费用较低等优点，成为临床上定量检测精子活性氧的主要手段。其中化学发光法多以鲁米诺为发光剂，通过化学发光计检测被精子活性氧氧化的鲁米诺的发光强度来确定活性氧含量。然而，不带电荷的鲁米诺分子是一种膜透过性分子，可以与精子内和精浆中各种活性氧反应，因此鲁米诺的化学发光分析提供的是精液活性氧总体水平，而无法特异性显示精子活性氧水平。实际工作中，精子中活性氧水平较精液中活性氧水平更具临床意义，更能反映精子质量优劣和男性生育能力。考虑到化学发光法无法直接对精子进行检测的缺点，科研人员使用荧光探针法来检测。临床测定精子活性氧所用的荧光探针法以2'-7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)为探针，以流式细胞仪为检测仪器。DCFH-DA是DCF的一种细胞可渗透的非荧光前体，它对细胞氧化还原状态的变化极为敏感。细胞内酯酶在两个酯键处裂解DCFH-DA，产生相对极性且细胞膜不可渗透的产物H2DCF。该非荧光分子在细胞内积累，随后被精子内ROS氧化产生强荧光产物DCF，再通过流式细胞仪检测荧光的增加来监测精子的ROS水平。但是，流式细胞仪具有以下两方面不足：一是流式细胞仪将受检样品分为单个小液滴通过检测区域，每个液滴里含有一个细胞，因此检测的是整个液滴的荧光强度，而不是精子自身的；二是流式细胞仪的激发光聚焦在特定的平面，待检的单个液滴会因为偏离聚焦平面导致收集的散发荧光不能准确反映其荧光物质含量，进而导致无法准确测量ROS含量。因此，流式细胞仪只能给出精子胞内荧光信号是否超过设定荧光值的判断(Yes or No)，无法准确计算荧光值的高低，因而最终报告的结果是：超过荧光设定值的精子的“比例”，并不是真正的精子胞内活性氧的“含量”。综上所述，现有方法均无法直接定量检测精子胞内的活性氧水平，该研究是生殖临床检测领域内的一大空白。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法，包括以下步骤：