[发明专利]一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法及其应用

权利要求书

1.一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法，包括以下步骤：

样品处理：将精液置于37℃孵育后，离心保留沉淀；沉淀中加入清理液混匀，重复多次离心去上清的操作；向最后一次的沉淀中加入稀释后的染色液，混匀；37℃恒温避光孵育；离心，沉淀用PBS混匀；离心，沉淀用PBS混匀，得到精子悬液；

精子定位：将精子悬液置于培养皿中，于单细胞分析仪下进行检测，调节显微镜使精头清晰显示在视野中央，调节微操系统和细胞定位系统，使探头定位到精子头部，呈现紧贴精子头部同时又不会使精子出现形变或者位移的状态；

活性氧水平测量：根据单细胞分析仪的操作说明进行荧光检测，得到荧光值A；

基线处理：得到计数值A后，打开显微镜侧舱门，打开显微镜侧卤素灯，调节微操系统和细胞定位系统，将光探头移动到精子头部周围30μm处，同时保证探头激光不会照射到该精子和周围精子；关闭显微镜侧照明灯和卤素灯，缓慢关闭显微镜侧舱门以防止探头移位，开始光子计数；30S后计数自动停止，保存计数结果，多次操作取平均值记作B，表示被测精子的背景基线值；A与B的差值特异性代表样品精子胞内活性氧水平。

2.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

样品处理：将精液置于37℃孵育后，离心保留沉淀；沉淀中加入清理液混匀，重复多次离心去上清的操作；向最后一次的沉淀中加入稀释后的染色液，混匀；37℃恒温避光孵育；离心，沉淀用PBS混匀；离心，沉淀用PBS混匀，得到精子悬液；

精子定位：将精子悬液置于培养皿中，于单细胞分析仪下进行检测；单细胞分析仪的操作包括：打开卤素灯，调节光源强度及显微镜焦距，让精子在4倍物镜下能显示清晰；将直径与精子头部相近的激发光探头装配到分析仪显微操作系统动力端；在显微镜下观察的同时调节微操系统，让探头在4倍物镜下浸入液滴，并清晰地显示在视野中央；将显微镜物镜调整为10倍，调节显微镜微调旋钮、微操系统和细胞定位系统，使精子和探头清晰显示在视野中央；将显微镜物镜调整为20倍，调节显微镜微调旋钮、微操系统和细胞定位系统，使精子和探头清晰显示在视野中央；将显微镜物镜调整为40倍，调节显微镜微调旋钮、微操系统和细胞定位系统，使精子和探头清晰显示在视野中央；将显微镜物镜调整为60倍，调节显微镜微调旋钮让精头清晰显示在视野中央，调节微操系统和细胞定位系统，使探头定位到精子头部，呈现紧贴精子头部同时又不会使精子出现形变或者位移的状态；

活性氧水平测量：打开触屏控制面板上激发光源电源按钮，点击计算机桌面的“SCanalysis”图标，打开软件控制界面，单击“LASER”图标，点击“+”，提示连接端口及设备，选择“Com7-DC4100-4”，点击“ACCEPT”，连接相应的激发光源；由于本专利使用染料激发波长为490nm，散发荧光波长为530nm，所以点击蓝色“圆形控件”，同时把过滤组块调节到B组块；打开软件控制界面，单击“PHOTON COUNTING”，进入计数器工作界面，选择左侧串口号为“com1”，点击“设置”，单次测量时长设置为30S，门控时间设置为1000ms，稳定时间设置为10ms，脉冲对分辨时间设置为20ns；当显示参数设置成功后，即可进行荧光检测；关闭显微镜侧照明灯和卤素灯，缓慢关闭显微镜侧舱门以防止探头移位，点击“PHOTON COUNTING”的“开始”按键以开始光子计数；30S后计数自动停止，保存光子计数结果A；A表示精子头部所在区域散发出的荧光值；

基线处理：得到计数值A后，打开显微镜侧舱门，打开显微镜侧卤素灯，调节微操系统和细胞定位系统，将光探头移动到精子头部周围30μm处，同时保证探头激光不会照射到该精子和周围精子；关闭显微镜侧照明灯和卤素灯，缓慢关闭显微镜侧舱门以防止探头移位，点击“PHOTON COUNTING”的“开始”按键以开始光子计数；30S后计数自动停止，保存计数结果B1；再重复1-3操作2次，总共可得到三个被测精子头部周围30μm处背景荧光值，B1、B2、B3，其平均值B表示被测精子的背景基线值；A与B的差值则能特异性代表该精子胞内活性氧水平。

3.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的单精子活性氧的定量检测方法，其特征在于：精液与清理液的用量体积比为0.3:2。