[发明专利]一种rRNA沉默的RNA文库构建方法及试剂盒

说明书

本发明提供一种制备rRNA沉默的RNA文库的方法及其使用的试剂或试剂盒。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种制备rRNA沉默的RNA文库的方法及其使用的试剂或试剂盒。

背景技术

高通量测序技术又称为第二代测序技术，可简写为NGS，是指一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的技术，其测定序列长度一般较短。

转录组测序的一个主要问题是存在干扰性RNA分子。例如，核糖体RNA(rRNA)是总RNA中最丰富的分子，其中通常超过90％的总RNA为rRNA。然而，核糖体RNA提供的关于转录的信息很少。在应用中，如RNA测序(RNA-seq)时，最大程度提高从测序运行接收到的信息量是极其令人感兴趣的。如果文库构建涉及丰富的rRNA，大部分的测序能力将用于测序这些无所不在的分子，从而减少研究其余转录组可用的能力。因此，宝贵的测序资源被浪费。此外，存在核糖体RNA可能会导致低信噪比，从而难以检测感兴趣的RNA种类。因此，除去rRNA和/或其它不需要的RNA提高了下游测序的价值。为了提供不含rRNA或其它不需要的RNA种类的测序文库，现有技术中开发了几种方法。

近年来，科研工作者们已经开发出多种方法以去除以rRNA为代表的非目标RNA。这些方法使用不同RNA之间的方方面面区别设计去除手段，如大小、序列特点、5’磷酸基、二级结构、丰度等，都可作为去除方法的依据；同时，也有若干商业化的试剂盒可用于去除非目标RNA。

首先要说明的是，对于真核生物，因其mRNA具有poly(A)尾的结构，因此很容易用poly(T)加以富集纯化进而去除其它RNA，或是直接用poly(T)引物进行合成cDNA；而原核生物的mRNA并不具备这样的结构，因此去除原核生物总RNA中非目标RNA，具有更高的技术难度。因此下文要详述的rRNA去除方法，均是针对包括原核生物与真核生物在内的，普遍适用的方法。

PolyA RNA可采用普通方法分离，例如利用以poly(T)寡核苷酸作官能化，从而可相应捕获PolyA RNA的磁性珠。从polyA RNA制备测序文库的优点在于，不携带polyA尾的RNA，例如rRNA不会从总RNA中回收，并且相应地不会被带入测序反应。因此，从利用polyARNA产生的测序文库中获得的大多数序列对应于确实携带polyA尾的蛋白编码mRNA。然而，利用纯化的polyA RNA制备测序文库也有缺点。有几种类型的RNA不带有polyA尾，并因此在polyA富集中丢失，但仍是转录组测序所感兴趣的。polyA富集导致作为转录组重要组成部分的非聚腺苷酸化mRNA序列损失。某些真核mRNA，例如那些编码组蛋白的，也不携带polyA尾，其它携带polyA尾太短，从而无法通过寡聚dT有效捕获。此外，该方法不能用于原核mRNA，因为它们未聚腺苷酸化。再一缺点是，polyA富集需要高品质的完整的总RNA作为输入材料。PolyA富集对于降解的RNA样本不可行，因为只有携带polyA尾的片段才能被捕获。