[发明专利]一种大规模分离干细胞旁分泌蛋白与分泌体囊泡的方法

说明书

一种大规模分离干细胞旁分泌蛋白和分泌体囊泡的方法，具体为利用双重滤过快速、大量提取粒径在20nm～200nm之间的蛋白与外泌体囊泡的方法，本发明利用两个管膜孔径不同的血浆过滤器实现对干细胞上清液中所含分子粒径进行限制，筛选出20nm～200nm符合干细胞旁分泌蛋白和外泌体囊泡的直径区间内的分子，利用二次分离，实现连续大量获得旁分泌蛋白和外泌体囊泡。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种大规模分离干细胞旁分泌蛋白与分泌体囊泡的方法。

背景技术

目前人类对干细胞有了新的认知，除了分化为各种组织细胞外，干细胞主要通过旁分泌蛋白以及外泌体这两大类活性物质来实现其功能。但旁分泌蛋白与外泌体囊泡为活性物质，利用现有超速离心、密度梯度离心、超滤等方法，处理量小，效率低，并不能满足生产需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用双重滤过快速、大量提取粒径在20nm～200nm之间的蛋白与外泌体囊泡的方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种大规模分离干细胞旁分泌蛋白与分泌体囊泡的方法，包括以下步骤：

(1)将血细胞分离管路接入血细胞分离机上；

(2)向血细胞分离管路通入生理盐水预充管路；

(3)将中空纤维膜孔径为200nm的血浆过滤器接入到血细胞分离管路中，并使用2000mL生理盐水冲洗血浆过滤器；

(4)设置血细胞分离机的参数，根据过滤体积，在设备上设置分离体积，设置区间为500～5000mL，流速设置为30～80mL/min；

(5)将装有干细胞上清液的袋子与血细胞分离管路的进液路连接，将空的无菌收集袋与血细胞分离管路的出液路连接；

(6)启动血液细胞分离机，执行分离程序；分离结束后，无菌收集袋中得到分子直径＜200nm的滤液，取下中空纤维膜孔径为200nm的血浆过滤器，换上中空纤维膜孔径为20nm的血浆过滤器，同时取下装有滤液的无菌收集袋，并使用2000mL生理盐水冲洗血细胞分离管路和血浆过滤器；

(7)将新的空无菌收集袋接入血细胞分离管路的收集管路，装有滤液的无菌收集袋接入血细胞分离管路的进液路；

(8)再次启动血细胞分离机，执行分离程序，原滤液中粒径＞20nm的粒子将会被截留，旁分泌蛋白与外泌体囊泡直径多数＞20nm，被截留下来，进入接在收集管路的无菌收集袋，即可获得旁分泌蛋白与外泌体囊泡混合物。

进一步地，所述血细胞分离管路包括，进液路、盐水入口、离心管盘、压力感应头、回流路、回流阀、收集路和出液路，其中离心管盘、压力感应头和回流阀均为血细胞分离机的组成部分。

进一步地，所述血细胞分离机选用德国造的血细胞分离机COM.TEC。

本发明的优点：

本发明利用两个管膜孔径不同的血浆过滤器实现对干细胞上清液中所含分子粒径进行限制，筛选出20nm～200nm符合干细胞旁分泌蛋白和外泌体囊泡的直径区间内的分子，利用二次分离，实现连续大量获得旁分泌蛋白和外泌体囊泡。

附图说明

图1为所述血细胞分离管路的连接示意图；

图中各标识符号含义如下：

1-进液路；2-盐水入口；3-压力感应头；4-回流阀；5-回流路；6-血浆过滤器；7-出液路；8-收集路；9-离心盘管。

具体实施方式