[发明专利]检测黄曲霉毒素B1的探针组、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉毒素B1的探针组、试剂盒、传感器系统及其应用。本发明基于酶辅助靶标循环扩增策略成功构建了一种用于AFB1高灵敏检测的探针组，所设计的适体探针H1‑S1和发夹探针H2，对AFB1的检测灵敏度高，线性范围宽，特异性好，且探针组以G‑四链体/氯化血红素DNA酶为信号分子，不需要任何的化学修饰和荧光标记，制备成本低。利用上述探针组对靶标AFB1检测时整个扩增反应在等温均一的溶液中进行，不需要复杂的分离程序和耗时的热循环，操作简单。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉毒素B1的探针组、试剂盒、传感器系统及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素(AFT)是一类由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的带有双呋喃环和香豆素结构的毒素，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最大，是目前已知致癌性最强的天然毒素，1993年被国际癌症研究机构(IARC)划定为1类致癌物。中药材在生产、加工、贮藏、运输等过程中，受温度或湿度的变化极易发生霉变而污染黄曲霉毒素。《中国药典》2020版收载了24种中药材中黄曲霉毒素残留的限量检测，规定其中AFBl的含量不得高于5μg/kg。通过文献调研发现中药材或中药饮片中受黄曲霉毒素污染的情况十分普遍。杨美华等检测了14种中药材的29批样品，发现被AFB1污染的有12批，含量最高的达到32.18μg/kg。沈紧治等对35种中药饮片中AFB1的含量进行测定，结果有17种中药饮片被AFB1污染。赵祥升等整理并分析了2000年以来中药中AFB1检测呈阳性结果的文献，统计显示149种中药的1168批样品中检测有AFB1，阳性样品超标率达到52.40％(Yang M H,Chen J M,Zhang XH.Chromatographia,2005,62(9):499.沈紧治,王政,苏玉纯.国际中医中药杂志,2019,6(41):614-617.赵祥升,应光耀,魏建和,孙华,杨美华.中国药物警戒,2018,15(10):608-616.)。

目前，黄曲霉毒素的检测方法有酶联免疫吸附测定法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS)等。这些方法定量准确、灵敏度高、抗干扰性强，但成本高昂、操作繁琐、费时耗力，不利于中药中黄曲霉毒素的快速检测，难以普及。近年来新发展起来的核酸扩增技术，不管是在仪器要求还是实际操作方面，都比传统的检测技术有了长足的进步，不仅摆脱了对精良设备的依赖，操作上也更为简单方便。酶辅助靶标循环扩增技术是基于核酸内切酶/核酸外切酶水解方式的差异性与核酸适配体技术、酶切循环效应、纳米技术、荧光标记技术等相结合，发展而成的一种等温核酸扩增技术。它具有反应条件温和、扩增效率高、能在恒温条件下进行等优点。酶辅助靶标循环扩增技术结合荧光、比色、化学发光和电化学发光等检测技术可以实现生物分子的高灵敏检测。

G-四链体/氯化血红素DNA酶是一种由富含鸟嘌呤碱基G的核酸四链体和氯化血红素(hemin)形成的生物催化DNA酶。它具有类似辣根过氧化物酶(HRP)的活性，可以在氯化血红素作用下催化H₂O₂介导的多种底物的氧化，比如3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)、2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)。与其他DNA酶或蛋白酶相比，G-四链体/氯化血红素DNA酶具有明显的优势，包括较低的制备成本、不易水解、易于修饰以及较高的热稳定性。因此，G-四链体/氯化血红素DNA酶被广泛用于核酸、蛋白质、金属离子和小分子的高灵敏度检测。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的中药中黄曲霉毒素检测成本高昂、操作繁琐、费时耗力和难以普及缺陷，从而提供一种简单、灵敏、低成本的免标记的探针组、试剂盒、传感器系统以及检测方法，用于检测黄曲霉毒素B1。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

探针组，包括：