[发明专利]转录因子ORCA3沉默型长春花培养体系的构建方法及其应用

说明书

本发明是转录因子ORCA3沉默型长春花培养体系的构建方法及其应用。主要步骤包括通过病毒介导的基因沉默技术将含有大麦条纹花叶病毒遗传信息的ORCA3沉默载体通过农杆菌侵染烟草植株，将表达出来的ORCA3基因沉默相关蛋白接种于长春花叶片上，以沉默长春花中ORCA3的表达，通过qRT‑PCR检测ORCA3沉默后TIAs生物合成关键酶基因的表达情况。ORCA3侵染烟草后，实验组叶片出现白斑，伴随着叶片不同程度的卷曲，并且还出现了褪绿发黄的现象；病毒蛋白接种长春花后，长春花叶片也出现发黄的现象；qRT‑PCR实验结果表明，相比较于对照组，长春花中的TIAs生物合成关键酶基因表达量除了SGD外均有大幅度下降，其中D4H，G10H，GES，IRS，LAMT，STR，TDC的表达量分别为对照组的0.24，0.10，0.37，0.89，0.04，0.001，0.09倍。

本发明属于通过基因工程技术研究中草药中活性成分生物合成及其调控的方法，具体实验步骤涉及到ORCA3沉默载体的构建、ORCA3沉默载体的转化、烟草叶片的侵染及长春花叶片的接种。通过沉默长春花中ORCA3基因的表达，研究ORCA3的基因调控网络，得到用于研究长春花萜类吲哚生物碱(Terpenoid indole alkaloids，TIAs)的ORCA3沉默型长春花培养体系。

背景技术

药用、观赏植物长春花[Catharanthus roseus(L.)Don]又名金盏草、四时春，为夹竹桃科(Apocynaceae)长春花属(Catharanthus)的多年生草本植物，原产于南亚洲、非洲东部等地。相对于其他植物，长春花植株拥有丰富的生物碱类次生代谢物，大部分生物碱具有显著的生物活性，如长春新碱、阿玛碱为临床上广泛使用的药物。另外，长春花植株因其色彩鲜艳，花朵优美等优点成为一种极受欢迎的观赏性植株。

长春花植株体内共有超过130多种生物碱类物质，其中大部分都是TIAs，这些TIAs大多具有药理作用，主要包括二萜类吲哚生物碱长春碱(Vinblastine)与长春新碱(Vincristine)，单萜类吲哚生物碱阿玛碱(Ajmalicine)与文多灵(Vindoline)，二氢萜类吲哚生物碱长春质碱(Catharanthine)等。

许多TIAs都在临床上得到了广泛的应用，其中以长春碱与长春新碱为代表的天然抗肿瘤类药物目前已经在临床上广泛地用于何杰金氏病、急性淋巴细胞型白血病、恶性淋巴肿瘤等疾病以及一些其他癌症的治疗；单萜类吲哚生物碱阿玛碱与蛇根碱在临床上主要用于治疗高血压等疾病；而文多灵和长春质碱等生物碱由于其显著的降血糖的药理活性被广泛用于糖尿病的治疗，并且他们还有很好的降血脂的疗效。

虽然长春花植株体内含有众多的具有药用价值的TIAs，但是其含量极其低，并且从长春花中提取TIAs的过程极其复杂，提取效率也很低下，用文多灵与长春质碱作为原料进行化学半合成的效率也不乐观，并且费用也很高，所以导致市场上的长春碱与长春新碱一直处于供不应求的状态。那么，如何提高长春花TIAs的含量成为当下的研究热点。

长春花TIAs生物合成途径是一个庞大且复杂的代谢网络，该代谢途径广泛分布于长春花的各个部位。这个复杂的代谢网络受到许多不同种类转录因子的高度调控，而其中ORCA3是长春花萜类吲哚生物碱生物合成中最重要的调控转录因子之一。目前，在长春花的生物碱合成途径中发现的中间产物、关键酶以及代谢产物总计达一百多个，并且该过程中还有少量细胞成分参与其中。尽管长春花中TIAs生物合成途径的调控机制十分复杂，如果能深入了解该途径的调控机制，就可通过代谢工程技术调控基因的表达量，如过表达或者沉默长春花生物碱合成过程中的一些关键基因，进而大幅度提高长春花中生物碱的含量，为利用生物技术大规模生产TIAs提供技术支持。

本方法通过病毒介导的基因沉默技术，借助大麦条纹花叶病毒，基于烟草的瞬时表达来实现长春花叶片ORCA3基因的沉默。

发明内容

本发明的目的在于构建ORCA3沉默型长春花培养体系。