[发明专利]由贴壁细胞在生物反应器中产生病毒

说明书

本发明提供了用于由贴壁细胞产生病毒的方法。该方法包括从生物反应器中生长的贴壁宿主细胞中释放病毒，以及通过超滤和/或透析过滤纯化所释放的病毒。该方法可用于制造病毒，包括用于临床应用，与传统的病毒制造方法相比，成本降低。

相关申请

本申请的主题与获许的发明人Joseph Cappello和Richard J.Aguilar于2018年6月27日提交的题为“(由贴壁细胞在生物反应器中产生病毒)”的美国申请系列No.16/020,850有关。在允许的情况下，该申请的主题通过引用全文并入本文。

技术领域

本发明提供了由贴壁细胞产生病毒的方法。

背景技术

病毒用作治疗手段。这些用途包括用作疫苗、基因治疗载体和病毒治疗剂。出于这些目的的病毒的制造包括在合适的宿主细胞中复制病毒，以及之后纯化来自宿主细胞的病毒。用于病毒复制的宿主细胞要么在锚定依赖性贴壁培养条件下生长，要么在悬浮培养条件下培养。悬浮培养的优点在于细胞可以在单个生物反应器中大体积培养。然而，有些病毒在悬浮培养的细胞中不能很好地复制。

病毒在其中复制较好的锚定依赖性细胞通常在滚瓶中进行培养，这需要大量的瓶子才能获得足够的数量。因此，这些工艺难以规模化，并且较为昂贵。在任何一种情况下，无论是使用贴壁培养条件还是悬浮培养条件，都是从一个或多个培养容器(生物反应器或滚瓶)中收获感染了病毒的细胞，并使其裂解以释放病毒。使用许多不同的步骤从宿主细胞衍生的全部组分中纯化病毒，包括均化、超声处理、离心、过滤、亲和纯化、色谱法和密度梯度超速离心中的一个或多个。病毒制造中涉及的培养条件和纯化步骤增加了制造工艺的复杂性和成本，并且可能导致低产量。因此，需要更简单且可规模化的病毒制造方法。

发明内容

本发明提供了用于以高产率制造病毒的简化的可规模化方法。这些方法使用病毒感染的锚定依赖性细胞。根据这些方法，病毒从宿主细胞中释放出来，而宿主细胞组分基本上保持附着在培养表面上。宿主细胞衍生的组分与细胞残留物保持在一起，而病毒被释放到细胞培养基中，通过简化的、具有成本效益的超滤或透析过滤一步工艺或超滤和透析过滤两步工艺对病毒进行纯化。纯化工艺产率高，并且可以在一天或更短的时间内进行。该工艺可以用在适合培养锚定依赖性细胞的生物反应器中生长的细胞进行，从而将简化的纯化方法与生物反应器放大的优点相结合。可以感染并在可以以贴壁形式生长的细胞中生长的任何病毒，特别是包膜病毒，都可以通过这些方法制造。

在这些方法/工艺中包括从在生物反应器中培养的贴壁细胞中产生病毒的方法/工艺。这些方法包括在生物反应器中从贴壁宿主细胞中释放病毒，并通过超滤和/或透析过滤纯化所释放的病毒。本文描述了此类方法的各种实例和方面。

本发明提供了用于产生病毒的方法(工艺)。该方法包括以下步骤：a)在生物反应器中培养包含病毒的宿主细胞，其中该生物反应器含有用于生长贴壁细胞或贴壁细胞捕获在其中的基质，其中该基质是生物相容的；细胞被捕获在基质中和/或粘附在基质上；并且基质的密度使得细胞在裂解和处理以释放病毒的条件下保持粘附，并且细胞培养基在基质中的流动足以使细胞生长；b)处理细胞，以使其裂解，并将病毒释放到生物反应器中的培养基中；然后c)在无需进一步处理的情况下，仅以一个或仅以两个步骤纯化从细胞培养基中释放的病毒。该一个步骤是超滤或透析过滤；而该两个步骤是超滤和透析过滤。不采用其它纯化步骤。因此，使细胞裂解并从细胞中释放病毒后进行的纯化仅通过超滤和/或透析过滤来实现。纯化仅以一个步骤或两个步骤实现。纯化可以在1天或更短的时间内完成。

生物反应器含有贴壁细胞粘附在其上，而悬浮细胞捕获在其中的基质或表面。基质(或大载体(macrocarrier)或基底或表面)可以是非固定的附着表面。该基质或表面可选自但不限于悬浮的微载体珠、纤维或编织网。该基质或表面可以是固定附着表面。该生物反应器可以是，例如，填充床生物反应器。本领域技术人员可以选择其它配置，只要生物反应器含有用于在生长和裂解过程中保留细胞的基质或表面即可。