[发明专利]人造血干细胞和祖细胞中α-珠蛋白基因座处的靶向整合

说明书

本公开内容提供了特别是通过用编码治疗性蛋白的转基因替换造血干细胞和祖细胞(HSPC)中的HBA1或HBA2基因座，对所述HSPC进行遗传修饰的方法和组合物。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年11月15日提交的美国临时专利申请第62/936,248号的优先权，该申请通过引用以其整体并入本文。

关于在联邦资助的研究和开发下作出的发明权利的声明

本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)给予的第HL135607号基金的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

背景

β-地中海贫血是世界上最常见的遗传性血液病症之一，全球发病率为1/100,000(1)。患有这种疾病的患者遭受了严重的贫血，并且即使接受重症监护，中位预期寿命也只有30岁(2-4)。该疾病最严重形式—重型β地中海贫血—是由整个β-珠蛋白(HBB)基因的纯合(或复合杂合)功能丧失突变引起的。这会导致HBB蛋白损失，导致严重的贫血并降低红血细胞(RBC)向全身输送氧气的能力。未配对的α-珠蛋白(来自HBA1和HBA2基因)的积累会导致显著的红细胞毒性，导致患者中出现贫血。事实上，已知疾病严重程度与β-珠蛋白和α-珠蛋白链之间的不平衡程度直接相关(5)。目前对β-地中海贫血的护理标准包括频繁输血结合铁螯合疗法，使其成为年轻人中最昂贵的遗传病之一(6)。目前，这种疾病的唯一治愈策略是来自免疫匹配供体的同种异体造血干细胞移植(HSCT)。然而，在大多数情况下，没有匹配的供体可用于同种异体HSCT，并且即使确定了一名供体，来自这些供体的移植物也存在免疫排斥和移植物抗宿主病的风险(7)。

一种潜在的理想治疗包括分离患者来源的造血干细胞和祖细胞(HSPC)，引入HBB以恢复HBB蛋白水平，然后对患者自身校正的HSPC进行自体HSCT，这不会带来免疫排斥的风险。采用这种逻辑，已经开发了几种基因疗法作为β-地中海贫血的潜在治愈措施，主要是通过使用慢病毒载体递送HBB转基因进行(8，9)。虽然这些方法已经显示在β-地中海贫血的人类临床试验中将HBB恢复到治疗水平(10)，但使用慢病毒和逆转录病毒载体进行递送导致半随机基因组整合，这能够使肿瘤抑制基因失活或激活癌基因。事实上，HSPC中的半随机整合已经显示导致克隆扩增、骨髓发育不良和急性髓样白血病(11-14)，其中一个实例被证明是致命的(15)。此外，慢病毒基因治疗方法虽然达到了对较轻形式的输血依赖性β-地中海贫血的注册状态(registration status)，但并未导致严重形式的疾病的输血独立性。

由于这些剩余的安全性和功效问题，已经开发了替代策略，其采用基因组编辑(包括锌指核酸酶和CRISPR/Cas9系统)来启动位点特异性DNA双链断裂(DSB)以使胎儿血红蛋白的阻遏物失活，胎儿血红蛋白的上调可以弥补HBB的缺乏(16)。然而，有人担心由此产生的胎儿血红蛋白上调可能不足以挽救β-珠蛋白:α-珠蛋白失衡，以及在胎儿血红蛋白自然沉默的成年患者中，这种上调可能不会持续存在(17，18)。而且，这种方法没有解决β-地中海贫血的遗传原因—HBB失活—并且可能无法在体内充分挽救疾病表型。此外，所有这些疗法仅用于弥补HBB的缺乏，并不会降低α-珠蛋白的水平。

因此，需要新的、安全且有效的方法以在体内或离体将HBB或其他治疗性转基因引入自体HSPC和红血细胞中。本公开内容满足了这种需要并且还提供了其他优势。

概述

在一方面，本公开内容提供了遗传修饰来自对象的造血干细胞和祖细胞(HSPC)的方法，所述方法包括将包含与HBA1基因序列或HBA2基因序列杂交的序列的引导RNA、RNA引导的核酸酶和包含编码蛋白质的转基因的供体模板引入所述HSPC中，其中所述RNA引导的核酸酶在所述细胞中切割所述HBA1基因序列或所述HBA2基因序列，但不同时切割所述HBA1基因序列和所述HBA2基因序列；其中将所述转基因整合至所述切割的HBA1基因序列或HBA2基因序列中；从而生成遗传修饰的HSPC，其中所述整合的转基因导致所述蛋白质在所述遗传修饰的HSPC中表达。