[发明专利]人造血干细胞和祖细胞中α-珠蛋白基因座处的靶向整合

权利要求书

1.遗传修饰来自对象的造血干细胞和祖细胞(HSPC)的方法，所述方法包括：

将包含与HBA1基因序列或HBA2基因序列杂交的序列的引导RNA、RNA引导的核酸酶和包含编码蛋白质的转基因的供体模板引入所述HSPC中，其中

所述RNA引导的核酸酶在所述细胞中切割所述HBA1基因序列或所述HBA2基因序列，但不同时切割所述HBA1基因序列和所述HBA2基因序列；其中将所述转基因整合至所述切割的HBA1基因序列或HBA2基因序列中；从而生成遗传修饰的HSPC，其中所述整合的转基因导致所述蛋白质在所述遗传修饰的HSPC中表达。

2.遗传修饰来自对象的造血干细胞和祖细胞(HSPC)的方法，所述方法包括：

将包含与HBA1基因序列或HBA2基因序列杂交的序列的引导RNA、RNA引导的核酸酶和包含编码蛋白质的转基因的供体模板引入所述HSPC中，其中

所述RNA引导的核酸酶在所述细胞中切割所述HBA1基因序列或所述HBA2基因序列，但不同时切割所述HBA1基因序列和所述HBA2基因序列；其中将所述转基因整合至所述切割的HBA1基因序列或HBA2基因序列中；从而生成遗传修饰的HSPC，其中所述引入导致与所述RNA引导的核酸酶、所述供体模板以及与HBA1基因序列和HBA2基因序列杂交的引导RNA的引入相比所述HSPC的基因组中易位事件减少。

3.遗传修饰来自对象的造血干细胞和祖细胞(HSPC)的方法，所述方法包括：

将包含与HBA1基因序列或HBA2基因序列杂交的序列的引导RNA、RNA引导的核酸酶和包含编码蛋白质的转基因的供体模板引入所述HSPC中，其中

所述RNA引导的核酸酶在所述细胞中切割所述HBA1基因序列或所述HBA2基因序列，但不同时切割所述HBA1基因序列和所述HBA2基因序列；其中将所述转基因整合至所述切割的HBA1基因序列或HBA2基因序列中；从而生成遗传修饰的HSPC，其中所述引入导致与所述RNA引导的核酸酶、所述供体模板以及与HBA1基因序列和HBA2基因序列杂交的引导RNA的引入相比所述HSPC的基因组中供体模板的脱靶整合减少。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在引入所述引导RNA、所述RNA引导的核酸酶和所述供体模板之前从所述对象分离所述HSPC。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述HBA1基因序列或所述HBA2基因序列包含3’UTR区。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶切割所述HBA1基因序列但不切割所述HBA2基因序列。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述HBA1基因序列包含SEQ ID NO:5的序列。

8.如权利要求6或7所述的方法，其中所述转基因整合至所述HBA1基因序列中。

9.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶切割所述HBA2基因序列但不切割所述HBA1基因序列。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述HBA2基因序列包含SEQ ID NO:2的序列。

11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述转基因整合至所述HBA2基因序列中。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述HSPC包含与野生型HBB基因相比包含突变的HBB基因。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述突变是疾病的病因。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述疾病是β-地中海贫血。