[发明专利]用于大麻素合成的酶及其制备和使用方法

说明书

提供了用于大麻素合成的多种酶及其制备和使用方法。还提供了具有异戊二烯基转移酶活性和/或香叶基焦磷酸酯:橄榄醇酸酯香叶基转移酶(GOT)活性的重组多肽，和用于生产CBGA的工程化的重组微生物，以及生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物的方法，所述方法包括以下步骤：使异源表达的异戊二烯基转移酶与香叶基二磷酸酯(GPP)和酸如橄榄醇酸(OA)反应。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年10月1日提交的美国临时专利申请序列号62/909,227、2019年11月27日提交的美国临时专利申请序列号62/941,689和2019年12月1日提交的美国临时专利申请序列号62/942,198的权益和优先权，将其通过援引并入本文。

序列表的引用

本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过援引以其全文并入本文。

技术领域

本申请涉及分子生物学，并且更特别地涉及用于大麻素合成的酶。

背景技术

大麻素化合物作用于大麻素受体的其他靶标，并显著影响大脑中神经递质的释放。大麻素化合物(如用于医疗目的的大麻二酚)的使用已在全球扩大，并且其立法也越来越被接受。因此，大麻素类化合物正在成为一类新型药物。然而，在生产大麻素化合物方面仍然存在许多挑战，所述大麻素化合物传统上是从植物中提取和纯化的。此外，很难使用目前已知的方法来生产多种大麻素类似物。因此，需要合成和生产大麻素化合物的新途径。

发明内容

根据一些方面，本申请涉及可用于在微生物宿主或酵母宿主中生产大麻素或大麻素中间体的酶，以及制备和使用此类酶的方法。

在某些实施例中，要求保护的生产大麻素的方法是对目前已知方法(如植物提取)的改进。从植物中提取大麻素涉及种植并收获天然含有大麻素的植物，并且然后使用本领域已知的多种提取方法提取化合物。由于大麻素在植物中天然混合，因此通常很难针对每个提取样本再现相同的提取和纯化特征。每种植物独特的遗传来源和生长条件使其进一步复杂。所得的不同大麻素特征导致样品各自具有不同的药物特征-从安全或监管角度来看是一个问题。最后，由于具有相似结构和大小的化合物混合的性质，纯化高纯度单一产物的能力非常具有挑战性。

因此，在某些实施例中，本申请提供了可用于在微生物或酵母宿主中生产大麻素的酶。示例实施例包括新型异戊二烯基转移酶以及在由异戊二烯基基团供体和酸生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物中制备和使用此类酶的方法。

在某些实施例中，本申请还提供了使用此类酶的方法，所述方法通过使用植物和微生物基因在微生物宿主或酵母宿主中的异源表达，来生产大麻素途径中的化合物，例如由异戊二烯基基团供体和酸生产的大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物。

在某些实施例中，本申请提供了生产大麻萜酚酸(CBGA)或其类似物的方法，所述方法包括以下步骤：使异戊二烯基转移酶与异戊二烯基基团供体和酸反应。

在一个实施例中，异戊二烯基转移酶具有大麻萜酚酸合酶(CBGAS)活性。

在一个实施例中，异戊二烯基转移酶从完整的、纯化的细胞提取物或其组合中获得。

在一个实施例中，异戊二烯基基团供体选自由以下组成的组：衍生自烯丙基异戊二烯基二磷酸酯(allylic isoprenyl diphosphate)(包括但不限于二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP；C5)、香叶基二磷酸酯(GPP；C10)和法呢基二磷酸酯(FPP；C15))的异戊二烯基部分。

在一个实施例中，异戊二烯基基团供体是GPP。

在一个实施例中，所述酸选自由以下组成的组：苔色酸(OSA)、丙基雷锁辛酸(divarinolic，DVA)和橄榄醇酸(OLA)、芹菜素、黄豆苷元、染料木素、柚皮素、橄榄醇、OA和白藜芦醇。

在一个实施例中，所述酸是橄榄醇酸。