[发明专利]用于筛选文库的方法

说明书

本发明涉及鉴定内切核酸酶的DNA靶序列的方法。用于该方法的底物文库和工程化改造内切核酸酶以具有改善的对特定底物的切割效率的方法形成本发明的其他方面。

发明领域

本发明涉及鉴定内切核酸酶的DNA靶序列的方法。用于该方法的底物文库和工程化改造内切核酸酶以具有改善的对特定底物的切割效率的方法形成本发明的其他方面。

发明背景

能够切割基因组内单个位点的内切核酸酶通过刺激非同源末端连接或同源重组而具有巨大的基因组编辑的潜力，并且多种工程化改造的内切核酸酶已经进入临床试验，包括CCR5-2246(靶向人CCR5)和VR24684(靶向人VEGF-A启动子)。尽管有能力工程化改造某些核酸酶(例如RNA引导的核酸酶，诸如Cas9/向导RNA、TALEN或锌指核酸酶)以对特定的独特靶序列具有特异性，但很明显这些核酸酶也可能与其他脱靶序列相互作用并在其他脱靶序列处切割。事实上，一些工程化改造的核酸酶与细胞毒性和致瘤性有关。在2016年11月15日的科学委员会会议上，FDA指出批准治疗性内切核酸酶时，需要考虑切割的特异性。

鉴于对脱靶切割的担忧，已经进行了各种尝试来表征与内切核酸酶经工程化改造以切割的靶位点密切相关的靶位点上的内切核酸酶的切割。WO2018/119010描述了使用寡核苷酸文库的方法，该方法易于大规模生产，并且该方法与自动化相容。然而，该方法具有低信噪比，并且需要高切割率以检测信号。因此，该方法使用非生理酶:DNA化学计量学进行，其本身可能导致人为现象(artefact)。

需要能够克服与现有技术相关的缺点的方法。

发明内容

在第一方面，本发明提供了底物文库，其包含多种DNA底物，其中该文库内的每个底物含有推定的靶序列，该推定的靶序列是能够独特地鉴定所述推定的靶序列的标识符DNA序列的5’，该标识符DNA序列是与反向PCR引物相同的序列的5’，并且其中文库内的双链DNA底物彼此之间的不同仅在于推定的靶序列和标识符DNA序列。

在一个实施方案中，底物文库包含多个双链DNA底物。

在另一个方面，本发明提供了用于制备包含如本文所定义的多个双链DNA底物的底物文库的方法。该方法包括用文库正向引物和文库反向引物对多个推定的靶序列进行PCR扩增的步骤，该推定的靶序列侧接有a)与所述文库正向引物互补的序列和b)与所述文库反向引物序列的部分相同的序列，其中文库反向引物是含有不同标识符序列的DNA序列的异质混合物，该不同标识符序列位于与反向引物互补的所有序列共有的序列的5’，并且其中不同标识符序列的数目以摩尔超过推定的靶序列的数目。

另一方面，本发明提供了用于鉴定内切核酸酶的DNA靶序列的方法，其包括以下步骤：

a)在合适的条件下使如本文所述的底物文库与内切核酸酶接触以允许切割；

b)将经内切核酸酶处理的文库与包括与“切割”PCR引物互补的序列的DNA序列连接；

c)用切割和反向PCR引物对经切割的底物进行PCR扩增；和

d)测序扩增的PCR产物；

其中通过标识符序列的序列鉴定切割产物中的DNA靶序列。

在又一方面，本发明提供了用于工程化改造内切核酸酶的方法，其包括：

a)使用相同的底物文库，用第一内切核酸酶和至少两种其他内切核酸酶进行如本文所述的鉴定内切核酸酶的DNA靶序列的方法，该其他内切核酸酶与第一内切核酸酶的不同在于内切核酸酶氨基酸序列内不同位置处的单个氨基酸变化；

b)比较步骤a)中测试的每种内切核酸酶在特定底物处的切割效率；

c)鉴定提高切割效率的不同位置处的至少两个氨基酸变化；