[发明专利]用于筛选文库的方法

权利要求书

1.底物文库，其包含多个DNA底物，其中所述文库内的每个底物含有推定的靶序列，所述推定的靶序列是能够独特地鉴定所述推定的靶序列的标识符DNA序列的5’，所述标识符DNA序列是与反向PCR引物相同的序列的5’，并且其中所述文库内的所述双链DNA底物彼此之间的不同仅在于所述推定的靶序列和标识符DNA序列。

2.根据权利要求1所述的底物文库，其中所述DNA底物是双链DNA底物。

3.根据权利要求2所述的底物文库，其中所述文库内的每个底物另外含有与正向引物互补的序列，其中此序列位于所述推定的靶序列的5’。

4.根据权利要求1所述的底物文库，其中所述DNA底物是单链底物。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的底物文库，其中每个推定的靶序列的序列与相关标识符序列的序列不相同。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的底物文库，其中所述底物文库中的所述推定的靶序列中的每一个与所述底物文库中的其他推定的靶序列长度相同，并且其中所述底物文库中的所述标识符DNA序列中的每一个与所述底物文库中的其他标识符DNA序列长度相同。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的底物文库，其中在所述文库中存在的所述推定的靶序列作为整体包括内切核酸酶的特征化靶序列和此特征化靶序列的所有可能的单个变体。

8.根据权利要求7所述的底物文库，其中所述内切核酸酶是RNA引导的核酸酶、大范围核酸酶、TALEN或锌指核酸酶。

9.根据前述权利要求中任一项所述的底物文库，其中每个DNA底物在其5’末端具有亲和标签。

10.用于制备如权利要求2至3和5至9中任一项所定义的底物文库的方法，其包括用文库正向引物和文库反向引物对多个推定的靶序列进行PCR扩增的步骤，所述推定的靶序列侧接有a)与所述文库正向引物互补的序列和b)与所述文库反向引物序列的部分相同的序列，其中所述文库反向引物是含有不同标识符序列的DNA序列的异质混合物，所述不同标识符序列位于与所述反向引物互补的所有序列共有的序列的5’，并且其中所述不同标识符序列的数目以摩尔超过推定的靶序列的数目。

11.用于鉴定内切核酸酶的DNA靶序列的方法，其包括以下步骤：

a)在合适的条件下使权利要求1中所定义的底物文库与内切核酸酶接触以允许切割；

b)将经所述内切核酸酶处理的文库与包括与“切割”PCR引物互补的序列的DNA序列连接；

c)用切割和反向PCR引物对所述经切割的底物进行PCR扩增；和

d)对所述扩增的PCR产物进行测序；

其中通过所述标识符序列的序列鉴定所述切割产物中的DNA靶序列。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述底物文库如权利要求3中所定义，并且其中步骤c)进一步包括用所述正向和反向PCR引物对未切割的底物进行PCR扩增。

13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述底物文库如权利要求9中所定义，并且其中所述亲和标签用于将步骤(b)的所述产物附接到固相，随后是洗脱经切割的底物的步骤。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述底物文库如权利要求4中所定义，并且其中，在洗脱经切割的底物的步骤之后和步骤(d)之前，有以下步骤：

i)切割所述亲和标签和洗脱未切割底物；

ii)将所述未切割的底物与双链DNA序列连接，所述双链DNA序列在5’到3’方向上含有与未切割的正向引物序列互补的序列；和

iii)用所述未切割的正向引物和反向PCR引物对所述经切割的底物进行PCR扩增。