[发明专利]基于活性的探针

说明书

本发明涉及新的基于光交联活性的探针(ABP)的开发及其用途。具体来说，带泛素的E2缀合酶被改造并且显示是RING泛素E1和E3连接酶以及去泛素化酶的有效ABP。

发明领域

本发明涉及新的基于光交联活性的探针(ABP)的开发及其用途。具体来说，带泛素的E2缀合酶被改造并显示为RING泛素E1和E3连接酶以及去泛素化酶的有效ABP。

发明背景

基于活性的蛋白质分析是研究酶生物学和促进治疗学发展的宝贵技术。泛素E3连接酶(E3)是最大的酶家族之一，可调节许多(病理)生理学过程。最大的子类型是RING E3，其成员超过600个。RING E3具有衔接子样活性，其可以受到多种调节机制的影响，并已成为有吸引力的药物靶点。据我们所知，不存在用于测量RING E3活性的基于活性的探针(ABP)。

泛素化是基本的翻译后修饰，其可调节正常的细胞生理学，并且其功能障碍可导致疾病发作(Rape,M.(2018).Nat Rev Mol Cell Biol 19,59-70)。泛素化通过酶级联反应进行，其涉及泛素E1激活(E1)、泛素E2缀合(E2)和泛素E3连接酶(E3)的顺序活动(Hershko,A.,和Ciechanover,A.(1998).Annu Rev Biochem 67,425-479.)。泛素(Ub)从E1中的催化半胱氨酸共价转移到E2中的催化半胱氨酸上，形成硫酯连接的E2中间体(E2～Ub)。已知存在招募E2～Ub并泛素化特定底物的数百个E3。E3机制的分歧已经导致了两个一般类别。“Cys E3”(其中有～50个)在底物修饰之前利用催化半胱氨酸与Ub形成共价硫酯连接的中间体(K.C.Pao等,Nature,2018,556,381-385；Scheffner,M.,Nuber,U.,和Huibregtse,J.M.(1995).Nature 373,81-83；Wenzel,D.M.,等(2011),Nature 474,105-108)。

然而，E3的最大类别是衔接子样E3，其中有600种不同的形式(Deshaies,R.J.,和Joazeiro,C.A.(2009).Annu Rev Biochem 78,399-434)。衔接子样E3不含催化性亲核试剂并催化Ub从E2～Ub直接转移至底物。这种衔接子样活性被多亚基Cullin-RING E3和～350个单多肽RING E3(以下简称为RING E3)利用。后者可以作为单体、同源二聚体或异源二聚体存在(Metzger,M.B.等(2014).Biochim Biophys Acta 1843,47-60)。活性调节是E3生物学的特别重要的方面，其确保细胞内稳态和适应性信号传导。失调会导致疾病发作，因此RING E3已成为有吸引力的治疗目标(Burgess,A.等(2016).Front Oncol 6,7)。然而，绝大多数RING E3的细胞作用和调节机制仍然知之甚少。此外，最近已经显示RING E3与靶向蛋白质降解策略(例如PROTAC方法论)兼容(Naito,M.,Ohoka,N.,和Shibata,N.(2019).DrugDiscov Today Technol,31,35-42；Spradlin,J.N.等(2019).Nat Chem Biol 15,747-755；Ward,C.C.等(2019).ACS Chem Biol.)。需要用于确定哪些RING E3在临床环境中有活性的工具，以进一步利用这一潜力。