[发明专利]噬菌体的不依赖于宿主的表达

说明书

本发明涉及用于在无细胞不依赖于宿主的表达系统中生产噬菌体的方法和相应的组合物，该组合物包含不同于所述噬菌体的宿主的生物体的细胞裂解物、至少一种噬菌体宿主特异性因子和噬菌体的基因组。还包括相应的试剂盒。本发明还涉及通过本发明的方法获得的噬菌体及其用途。

技术领域

本发明涉及用于在无细胞不依赖于宿主的表达系统中生产噬菌体的方法和相应的组合物，组合物包含不同于所述噬菌体的宿主的生物体的细胞裂解物、至少一种噬菌体宿主特异性因子和噬菌体的基因组。还包括相应的试剂盒。本发明还涉及通过本发明的方法获得的噬菌体及其用途。

背景技术

噬菌体是专门感染宿主细菌并利用细菌繁殖的病毒。噬菌体的生物技术应用非常广泛，从基于进化的选择方法，例如酶活性的进化改进(Esvelt等人2011)，到所谓的噬菌体展示，其可用于产生并优化生物药物，例如治疗性抗体(Bazan等人2012)，到噬菌体本身在噬菌体治疗中作为抗生素的替代品的用途(Barbu等人2016)。后者基于噬菌体特异性攻击和破坏病原菌(裂解)的天然能力。然而，基于噬菌体的治疗剂和诊断剂的开发和生产仍然受到用于噬菌体的简单且安全的生产方法中困难的阻碍。到目前为止，噬菌体是通过与合适的细菌/病原体一起培养产生的(Pirnay等人2018)。这需要遵守相应细菌的适当安全规定，以及培养它们的可能性。对于危险病原体，处理非常困难并且由于需要在特殊设施中经过专门培训的人员因此成本高昂。

相对于细胞表达，蛋白质的无细胞合成具有许多优势，尤其是在生产对于细菌有毒的蛋白质或将非天然氨基酸引入蛋白质时。蛋白质合成可以用裂解的细胞的转录和翻译装置进行。纯化后，其不含宿主DNA，并且能够通过外部添加DNA来表达期望的蛋白质。甚至可以同时合成多种蛋白质或代谢物(Garamella等人2016)。许多无细胞表达系统可用，其组成可能有很大差异。所谓的“PURE系统”(Shimizu等人2001)由纯化的蛋白质组成，而大肠杆菌的粗细胞提取物包含几乎所有的细胞内蛋白质，包括对于表达的不需要的那些(Sun等人2013)。在这种粗细胞提取物中，已经表明可以表达感染性野生型噬菌体(Shin等人2012)以及蛋白质(Garamella等人2016)。

然而，并不是所有的噬菌体都能在大肠杆菌细胞裂解物中容易地产生。因此，仅限于基于大肠杆菌的噬菌体。或者，细胞提取物也可以从其它细菌菌株中获得。然而，这与非常复杂的筛选以寻找获得也可以表达噬菌体的高质量细胞提取物的合适条件有关。此外，如果将噬菌体用作药物，则必须证明细胞提取物不含毒素和其它有害物质，如原噬菌体。因此，需要不依赖于噬菌体宿主生物体的高效、省力且通用的用于生产噬菌体的方法。

发明内容

本发明通过向源自不是噬菌体宿主的微生物的细胞裂解物中添加至少一种噬菌体宿主特异性因子或编码所述因子的核苷酸序列来解决该问题。因此，噬菌体可以在源自不同于噬菌体宿主的微生物的标准细胞裂解物中产生。

因此，本发明的第一方面涉及用于在无细胞不依赖于宿主的表达系统中生产噬菌体的方法，

-提供源自不同于所述噬菌体的宿主的微生物的细胞裂解物，

-添加至少一种噬菌体宿主特异性表达因子和/或编码所述至少一种噬菌体宿主特异性表达因子的核苷酸序列，

-添加噬菌体的基因组。

在一个实施方案中，细胞裂解物是大肠杆菌(E.coli)细胞裂解物。大肠杆菌细胞裂解物已得到充分研究和充分表征，例如关于毒素和其它潜在有害的化合物。因此，使用大肠杆菌细胞裂解物特别有利于生产用于医疗目的和在食品领域的应用的噬菌体。在这样的实施方案中，待产生的噬菌体的天然宿主通常不是大肠杆菌：例如，噬菌体可以是phi29，其天然宿主是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。