[发明专利]染色体重排的方法

说明书

本发明提供了用于生产具有染色体易位、缺失或倒位的细胞的方法。在一个实施方式中，所述的用于生产具有染色体易位的细胞的方法包括将位点特异性核酸酶引入所述细胞以在第一染色体和第二染色体中产生双链断裂；产生中间融合染色体，其包含所述第一染色体的第一区段、选择区和第二染色体的第二区段；以及在所述选择区侧翼的位点处产生双链断裂，从而产生融合染色体，所述融合染色体包含与所述第二染色体的所述第二区段的至少一部分连接的所述第一染色体的所述第一区段的至少一部分。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年6月19日提交的美国临时专利申请号62/863,829的优先权，其全部内容在此参考并入。

发明领域

本发明一般地涉及基因组编辑。更具体地，本发明涉及产生具有染色体重排(如染色体易位或倒位)的细胞的方法。

背景技术

基因组编辑或基因组工程允许人类操作以插入、缺失、修改或替代活生物体基因组中的DNA。通常，基因组编辑方法使用工程化核酸酶，如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统，以在基因组中的所需位置形成位点特异性双链断裂。然后通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)修复诱导的双链断裂，从而在基因组中的所需位置进行DNA插入、缺失、修饰或替代。

染色体重排是一种涉及天然染色体结构变化的突变类型，包括缺失、复制、易位和倒位。使用当前的基因组编辑技术产生具有所需染色体重排的细胞一直是一个挑战。需要开发新方法来产生所需的染色体重排。

发明内容

在一个方面中，本公开内容提供了一种用于生产基因组修饰的细胞的方法。在一个实施方式中，所述方法包括向细胞中引入：(1)靶向第一染色体中的第一位点的第一位点特异性核酸酶，所述第一位点将所述第一染色体分成所述第一染色体的第一区段和第二区段，(2)靶向第二染色体中的第二位点的第二位点特异性核酸酶，所述第二位点将所述第二染色体分成所述第二染色体的第一区段和第二区段，和(3)依次包含以下的供体DNA：5’同源臂，选择区，和3’同源臂，其中所述5’同源臂与在所述第一位点侧翼的所述第一染色体的所述第一区段中的区域同源，并且其中所述3’同源臂与在所述第二位点侧翼的所述第二染色体的所述第二区段中的区域同源。所述方法还包括产生中间细胞，所述中间细胞包含依次包含以下的中间融合染色体：所述第一染色体的所述第一区段，所述选择区，和所述第二染色体的所述第二区段。所述方法还包括向所述中间细胞中引入分别靶向第三位点和第四位点的第三和第四位点特异性核酸酶或位点特异性重组酶，其中所述第三位点和所述第四位点位于所述选择区侧翼，从而产生包含融合染色体的细胞，所述融合染色体包含与所述第二染色体的所述第二区段的至少一部分连接的所述第一染色体的所述第一区段的至少一部分。

在另一个实施方式中，所述方法包括：向细胞中引入：(1)靶向染色体中的第一位点的第一位点特异性核酸酶，(2)靶向所述染色体中的第二位点的第二位点特异性核酸酶，其中所述第一位点和所述第二位点将所述染色体依次分成第一区段、第二区段和第三区段，(3)依次包含以下的供体DNA：5’同源臂，选择区，和3’同源臂，其中所述5’同源臂与在所述第一位点侧翼的所述第一区段中的区域同源，并且其中所述3’同源臂反向地与在所述第二位点侧翼的所述第二区段中的区域同源。所述方法还包括产生中间细胞，所述中间细胞包含依次包含以下的中间融合染色体：所述第一区段，所述选择区，和所述第二区段，当与在所述染色体中的其方向相比时，所述第二区段颠倒了其方向。所述方法还包括向所述中间细胞中引入靶向第三位点和第四位点的第三和第四位点特异性核酸酶或位点特异性重组酶，其中所述第三位点和所述第四位点位于所述选择区侧翼，从而产生包含融合染色体的细胞，所述融合染色体包含与所述第二区段的至少一部分连接的所述第一区段的至少一部分，其中所述第二区段在所述染色体中的方向与其原来的方向相比是颠倒的。

在某些实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。