[发明专利]染色体重排的方法在审
申请号: | 202080045234.1 | 申请日: | 2020-06-19 |
公开(公告)号: | CN114008201A | 公开(公告)日: | 2022-02-01 |
发明(设计)人: | 郑起;孔令洁;R·雁如·蔡 | 申请(专利权)人: | 应用干细胞有限公司 |
主分类号: | C12N15/11 | 分类号: | C12N15/11 |
代理公司: | 北京市君合律师事务所 11517 | 代理人: | 张怡;顾云峰 |
地址: | 美国加利*** | 国省代码: | 暂无信息 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 染色体 重排 方法 | ||
1.一种用于生产基因组修饰的细胞的方法,所述方法包括:
向细胞中引入:
靶向第一染色体中的第一位点的第一位点特异性核酸酶,所述第一位点将所述第一染色体分成所述第一染色体的第一区段和第二区段,
靶向第二染色体中的第二位点的第二位点特异性核酸酶,所述第二位点将所述第二染色体分成所述第二染色体的第一区段和第二区段,和
依次包含以下的供体DNA:
5’同源臂,
选择区,和
3’同源臂,
其中所述5’同源臂与在所述第一位点侧翼的所述第一染色体的所述第一区段中的区域同源,并且
其中所述3’同源臂与在所述第二位点侧翼的所述第二染色体的所述第二区段中的区域同源;
产生中间细胞,所述中间细胞包含依次包含以下的中间融合染色体:
所述第一染色体的所述第一区段,
所述选择区,和
所述第二染色体的所述第二区段;和
向所述中间细胞中引入
(i)靶向第三位点的第三位点特异性核酸酶,和靶向第四位点的第四位点特异性核酸酶,其中所述第三位点和所述第四位点位于所述选择区侧翼,或者
(ii)靶向所述第三位点和所述第四位点的位点特异性重组酶,
从而产生包含融合染色体的细胞,所述融合染色体包含与所述第二染色体的所述第二区段的至少一部分连接的所述第一染色体的所述第一区段的至少一部分。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述细胞是哺乳动物细胞。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述位点特异性核酸酶中的任一种是锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应物的核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶或CRISPR/Cas蛋白。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述位点特异性核酸酶是CRISPR/Cas蛋白,并且所述方法还包括引入靶向在第一染色体中的所述第一位点的第一向导RNA和靶向在第二染色体中的所述第二位点的第二向导RNA。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述供体DNA包含第一重组酶识别位点和第二重组酶识别位点。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一染色体与所述第二染色体是相同的。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一染色体与所述第二染色体是不同的。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述选择区包含正选择标志物。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述正选择标志物是嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟素S抗性基因或荧光基因。
10.根据权利要求8所述的方法,其中所述选择区还包含负选择标志物。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述负选择标志物是胸腺嘧啶激酶基因。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述位点特异性核酸酶是CRISPR/Cas蛋白,并且所述方法还包括引入靶向所述第三位点附近区域的第三向导RNA和靶向所述第四位点附近区域的第四向导RNA。
13.根据权利要求1所述的方法,其中所述位点特异性重组酶是Cre重组酶、Flp重组酶或整合酶。
14.一种根据权利要求1所述的方法生产的基因组修饰的细胞。
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