[发明专利]封闭端DNA（CEDNA）产生中对REP蛋白活性的调节

权利要求书

1.一种从载体多核苷酸获得的DNA载体，其中所述载体多核苷酸对操作性地定位于第一反向末端重复DNA多核苷酸序列(ITR)与第二ITR之间的异源核酸进行编码，其中所述第一ITR和所述第二ITR中的至少一个ITR包括对应于AAV Rep结合序列的核苷酸序列，以在单个种类的Rep蛋白存在的情况下诱导所述DNA载体在细胞中复制，所述DNA载体可通过包括以下步骤的方法获得：

a.在至少具有DNA结合和DNA切口产生功能的单个种类的Rep蛋白存在的情况下在有效条件下将携带所述载体多核苷酸的细胞群温育足以诱导所述DNA载体在所述细胞内产生的时间，所述细胞群缺乏病毒衣壳编码序列，其中所述细胞不包括病毒衣壳编码序列，并且其中不存在其它种类的Rep蛋白；以及

b.从所述细胞中采集和分离所得DNA载体。

2.根据权利要求1所述的DNA载体，其中所述细胞不与对第二Rep蛋白进行编码的核苷酸序列接触。

3.根据权利要求1所述的DNA载体，其中所述单个Rep蛋白进一步具有解旋酶、连接酶和ATP酶功能。

4.根据权利要求1所述的DNA载体，其中所述Rep蛋白是AAV Rep蛋白。

5.根据权利要求4所述的DNA载体，其中所述Rep蛋白选自以下中的任何一种：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12 Rep蛋白。

6.根据权利要求4所述的DNA载体，其中所述Rep蛋白是AAV2 Rep 68蛋白。

7.根据权利要求4所述的DNA载体，其中所述Rep蛋白是AAV2 Rep 78蛋白。

8.根据权利要求7所述的DNA载体，其中所述Rep 78蛋白由不具有用于Rep 52的功能性翻译起始密码子的突变Rep78核苷酸序列编码。

9.根据权利要求8所述的DNA载体，其中所述突变Rep 78核苷酸序列对包括SEQ ID NO:530的氨基酸位置225处的突变的突变Rep 78蛋白进行编码。

10.根据权利要求9所述的DNA载体，其中SEQ ID NO:530的氨基酸位置225突变为甘氨酸(Gly)或苏氨酸(Thr)。

11.根据权利要求8所述的DNA载体，其中所述突变Rep 78核苷酸序列包括SEQ ID NO:530的序列或包括与SEQ ID NO:530具有至少95％序列同一性的序列并且至少具有DNA结合和DNA切口产生功能，并且不表达第二Rep蛋白。

12.根据权利要求1所述的DNA载体，其中所述ITR是细小病毒ITR。

13.根据权利要求12所述的DNA载体，其中所述细小病毒是依赖病毒。

14.根据权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体是具有共价封闭端的非病毒无衣壳双链DNA载体(ceDNA载体)。

15.根据权利要求14所述的DNA载体，其中可以通过以下来确认从所述细胞分离的所述ceDNA载体的存在：用在所述DNA载体上具有单个识别位点的限制酶来消化从所述细胞分离的DNA，并且在非变性凝胶上分析消化的DNA材料，以与线性和非连续DNA相比确认线性和连续DNA的特征带的存在。