[发明专利]用于CKO载体构建的引物组

说明书

本发明提供了用于CKO载体构建的引物组，其包含Seq ID No.1:5’‑ACGTAAACGGCCACAAGTTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCACATGAAGCAGCACGACT‑3’，(74bp)划线区域为LoxP序列；Seq ID No.2:5’‑GTGGATTCGGACCAGTCTGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA‑3’，(74bp)划线区域为LoxP序列。本发明引物序列的突变或缺失率几乎为～0％；且利用本发明的引物组构建CKO载体的周期只需要2～3周。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及高通量构建CKO载体的方法。

背景技术

基因修饰的模型动物在现在医学研究中必不可少，尤其今年新冠疫情的爆发，将基因编辑推到历史高峰。基因编辑技术也在不断更新，从传统的ES打靶技术到核酸酶技术，而核酸酶技术历经锌指核酸酶(ZFN)-转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)-CRISPR/Cas系统三代技术革新后，CRISPR/Cas9核酸酶技术在2020年荣获诺贝尔化学奖，如今在科研界更是一枝独秀。

常规的基因编辑技术有转基因(Transgenic gene)、基因敲除(Knock-out)、基因敲入(Knock-in)、RNA干扰(RNAi)。其中基因敲除技术是功能基因组学研究的重要工具，但是传统的基因敲除模型在胚胎致死基因的研究方便有一定局限性，条件性基因敲除(Conditional Knock-out，简写为CKO)在克服传统基因敲除缺陷的情况下，其能实现时间和空间调控基因删除的优势使得在研究领域颇受欢迎。条件性基因敲除是通过染色体位点特异性重组酶系统来实现的，常用的重组酶系统Cre-LoxP或Flp-Frt，近年Cre家族位点Dre-Rox也应用很多，其中Cre重组酶是最经典的工具，其最佳反应温度是37℃，因此在细胞或动物体内重组反应效率最高，使用也最广。基因敲除把两个LoxP位点放到目的基因一个或几个重要的外显子两端，制备出Flox小鼠，该目的基因表达不受LoxP插入的影响，而当该Flox小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，Cre酶的组织特异性表达可以促进目的基因两侧的LoxP位点发生重组，目的基因完整性被破坏，从而发生基因功能缺失，而该基因在其他组织或细胞表达正常。

CRISPR/Cas9编辑技术以其高效、操作简便、成本低等特点被广泛应用于基因敲除小鼠实验中，条件性基因敲除模型的制备流程：sgRNA位点确定-CKO载体构建-受精卵显微注射-F0嵌合体小鼠-具有生殖遗传的F1小鼠-F1小鼠与组织特异性工具鼠Cre交配获得条件性敲除的Fn小鼠。其中载体设计尤为重要，需要在KO区域的两端引入LoxP位点，常见的方法是在载体骨架上引入该位点，然后再将5’arm、CKO region、3’arm分别构建到骨架上，该方法非常耗时，载体构建周期需要6～8周。

另一种方法是将loxP位点在扩增引物的5’引入，因此扩增好的5’arm、CKOregion、3’arm可以一次性构建至骨架中，将周期缩短至2～3周但是该方法由于要引入LoxP位点和Overlapping序列，因此要合成超长的引物，目前的合成公司大于80bp的引物产量就非常低，而且突变或缺失的比例很高，每次合成的质量都有差异，价格和周期都相应增长。因此研发出一套高通量构建CKO载体的方法尤其重要。

发明内容

本发明所要解决的第一问题在于克服现有技术构建CKO载体，突变或缺失率较高的问题，提供了两条通用序列作为引物，能获得较高正确率以用于CKO载体构建。