[发明专利]一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用。对PCV2DNA中的GAS样基序进行突变，使得突变的PCV2DNA在病毒复制中不能与STAT5蛋白结合，并通过病毒拯救获得复制能力远低于野生型PCV2毒株的突变毒株。该突变毒株可以用于研究PCV2复制机制和减毒活疫苗，从而为PCV2的防控提供新思路。

技术领域

本发明涉及猪圆环病毒2型(PCV2)突变毒株的构建，具体涉及GAS样基序突变的PCV2病毒。

背景技术

PCV2感染造成机体产生免疫抑制，导致PCV2与其他病原体，例如，猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)及猪细小病毒(PPV)等混合感染，还使感染猪对疫苗保护性降低，严重威胁着养猪业的发展。虽然PCV2能在PK-15细胞中复制，但是PCV2的复制机制并不明确。研究PCV2 DNA复制机制成为目前研究PCV2复制机制关键环节之一。

信号传导与转录激活因子5(STAT5)属于信号传导及转录激活蛋白家族，是一种能与DNA结合的蛋白质。研究表明，人的STAT5蛋白通过与人细小病毒B19 DNA GAS样基序结合促进病毒DNA复制。

但对于PCV2而言，宿主细胞蛋白STAT5是否与病毒的蛋白或DNA结合，并且其结合后对病毒复制带来怎样的影响并未得到研究。同时，目前尚难以通过基因工程手段有效获得复制能力明显减弱的PCV2突变毒株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用，该突变毒株的复制能力远低于野生型PCV2毒株。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种突变的PCV2病毒，该突变的PCV2病毒(DNA)在复制中不能与宿主细胞内的STAT5蛋白结合，即所述PCV2病毒的突变位点位于野生型PCV2病毒DNA与STAT5蛋白结合的序列区域内。

优选的，所述野生型PCV2病毒DNA上存在用于与STAT5蛋白结合的GAS样基序。

优选的，所述PCV2病毒的突变位点位于野生型PCV2病毒(例如，DNA序列如GenBankNo.MH492006.1所示的PCV2 2b亚型毒株)DNA自复制起始点起的第1066nt～1074nt存在的GAS样基序(TTCTCTGAA)。

优选的，通过将上述GAS样基序突变为非GAS样基序(例如，ACGAAAGCC)，使得PCV2DNA(基因组DNA)在病毒复制中不能与宿主细胞蛋白STAT5结合，并导致PCV2病毒的复制能力明显减弱。

优选的，所述突变的PCV2病毒的DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

上述突变的PCV2病毒的制备方法，包括以下步骤：

1)通过序列比对分析PCV2病毒DNA包含的与STAT5蛋白保守的结合位点，然后扩增或人工合成突变的PCV2病毒的DNA序列，所述PCV2病毒的突变位点位于野生型PCV2病毒DNA与STAT5蛋白结合的序列区域内；

2)将上述突变的PCV2病毒的DNA序列环化后转染宿主细胞(例如，PK-15细胞)，然后进行培养和传代，得到突变的PCV2病毒。

优选的，所述步骤1)具体包括以下步骤：根据GAS样基序是STAT5蛋白保守的结合位点，以野生型PCV2病毒DNA为模板，通过重叠PCR扩增得到GAS样基序突变的PCV2病毒DNA。

优选的，所述野生型PCV2病毒选自PCV2病毒2b亚型(例如，DNA序列如GenBankNo.MH492006.1所示的毒株)。

优选的，所述重叠PCR采用的扩增引物为：

病毒DNA片段I引物：