[发明专利]一种高效构建细胞文库的电击转化方法

说明书

本发明涉及一种高效构建细胞文库的电击转化方法，所述方法包括：构建sgRNA表达细胞；将Cas9mRNA加入到所述sgRNA表达细胞中，进行电击转化反应。与现有技术相比，本发明方法通过改变构建细胞文库的方法及技术路线，最终形成一套能够快速高效构建细胞文库的方法，能够不受限于细胞起始量的限制，且能够显著缩短sgRNA细胞文库的构建时间，从而有效缩减人工成本和时间成本，并有效拓展细胞文库构建方法的适用范围。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术，更具体的涉及一种高效构建细胞文库的电击转化方法

背景技术

基因编辑技术能够让人类对目标基因进行定点“编辑”，从而实现对生物体基因组特定DNA片段的修饰。CRISPR-Cas系统是原核生物的一种获得性免疫系统，运用重复间隔序列转录所得的向导RNA(gRNAs)有助于Cas蛋白识别并切割外源致病RNA。CRISPR-Cas9系统是目前在真核生物中使用较为广泛的基因编辑工具，能够准确高效的实现对靶向基因的编辑。与此同时，CRISPR-Cas9系统也被广泛应用于高通量药物靶点的筛选中。在高通量筛选应用中，针对多个靶向基因设计导向RNA序列(sgRNAs)，运用酶切连接的方式将其插入表达载体后，形成sgRNAs质粒文库。该文库经慢病毒转染的方式成功整合到表达有Cas9的宿主细胞后，即可在宿主细胞内进行基因编辑，从而形成靶向基因功能缺失的细胞文库，可用于后续的药物靶点筛选。在该过程中，快速高效的构建可同时高效表达Cas9蛋白和sgRNAs的细胞文库以确保细胞编辑效率对于高通量筛选至关重要。

目前通常采用慢病毒侵染的方式构建Cas9蛋白/sgRNAs细胞文库，首先用慢病毒侵染的方式构建Cas9稳转细胞系，待Cas9蛋白在细胞内稳定表达后，筛选Cas9表达量较高且表达量均一的细胞进行大量扩增。待细胞数目扩增到足够量时，再运用慢病毒侵染的方式将sgRNAs导入Cas9稳定表达的细胞中，随着sgRNAs在细胞内的转录实现细胞文库的编辑。该方法可将Cas9/sgRNAs表达/转录元件随机插入宿主细胞基因组中，实现Cas9蛋白/sgRNAs的稳定表达/转录。但该方法构建细胞文库所需的细胞起始量大，细胞扩增所需时间长，不适用于原代细胞以及干细胞等细胞模型。

发明内容

为了解决现有技术中构建细胞文库所需的细胞起始量大，细胞扩增所需时间长等问题。本发明提供了一种高效构建细胞文库的电击转化方法。

本发明涉及：

1、一种高效构建细胞文库的方法，包括：

1)构建sgRNA表达细胞；和

2)将Cas9 mRNA通过电击转化导入所述sgRNA表达细胞中。

2、根据项1所述的方法，其中步骤1)中，通过病毒侵染方式构建sgRNA表达细胞。

3.根据项2所述的方法，其中所述病毒侵染方式中病毒感染复数不超过0.3。

4.根据项3所述的方法，其中所述病毒侵染方式中病毒感染复数为0.1-0.3。

5.根据项1-4任一项所述的方法，其中所述病毒为AVV或慢病毒。

6、根据项1-5任一项所述的方法，其中所述Cas9 mRNA与所述sgRNA表达细胞的比值为约1X10⁶-1X10⁷个细胞每1μg-120μg Cas9 mRNA，优选为约1X10⁶-1X10⁷个细胞每2μg-100μg Cas9 mRNA。

7、根据项1-6任一项所述的方法，其中当所述电击转化的细胞数为约1X10⁶时，所述电击转化的电压为200-400V，时长为1ms，脉冲数为1个。