[发明专利]一种CRISPR目标区间变异检测的分析方法

说明书

本发明公开了一种CRISPR目标区间变异检测的分析方法，1)将高质量测序数据使用flash软件将两条reads按照overlap进行合并，再使用cd_hit软件按照短序列与长序列完全相似的标准进行聚类，获得聚类结果；2)使用mafft软件将聚类结果与目标区间进行序列的多重比对，扫描目标区间，根据扫描结果查找出突变；3)根据步骤2)中找出的突变进行分类，再结合步骤1)中的聚类结果中每一个cluster的reads数除以总聚类的reads数，得到每个cluster条目对应分类的突变率；通过本发明的分析得到的结果更接近真实情况，提高了准确率。

技术领域

本发明涉及基因检测分析技术领域，尤其涉及一种CRISPR目标区间变异检测的分析方法。

背景技术

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)——规律成簇的间隔短回文重复和CRISPR-associated protein 9(Cas9)，共同组成了一套系统，是细菌用来抵御外源DNA入侵的天然防御系统。目前利用这个原理构建了很强的RNA引导的DNA靶向平台——主要用来基因组编辑、转录扰乱、表观遗传调控等。

CRISPR/Cas9从2013年以来，凭借其特有的敲除靶序列效果，迅速风靡科研界。与传统的siRNA文库和shRNA文库比较，有更加严苛的筛选标准，更有效去除假阳性，而且有着成本低廉、构建简单、操作方便的诸多优点。

而现有的CRISPR分析主要是集中在针对目标区间单位点碱基突变的分析，而忽略了完整序列在成功转导后的比率，从而造成假阳性的情况。

发明内容

本发明的提供一种CRISPR目标区间变异检测的分析方法。

本发明的方案是：

一种CRISPR目标区间变异检测的分析方法，包括下列步骤：

1)将高质量测序数据使用flash软件将两条reads按照overlap进行合并，再使用cd_hit软件进行聚类，获得聚类结果与每一类代表性序列；

2)使用mafft软件将聚类的代表性序列与目标区间进行序列的多重比对，扫描目标区间，根据扫描结果查找出突变；

3)根据步骤2)中找出的突变进行分类，再结合步骤1)中的聚类结果中每一个cluster的reads数除以总聚类的reads数，得到每个cluster条目对应分类的突变率；

4)将步骤1)中的聚类结果的reads数与步骤2)中的扫描结果统计每种cluster的丰度，然后结合步骤3)中突变率，筛选，获得分析结果。

作为优选的技术方案，步骤1)中的所述聚类为当长序列包含短序列时把短序列归为长序列。

作为优选的技术方案，所述步骤1)中高质量测序数据获得方法：

将原始二代下机数据按照barcode拆分成单个样本的fastq文件，将得到的所述fastq文件使用fastp软件过滤去接头处理得到高质量测序数据。

作为优选的技术方案，所述步骤1)中高质量测序数据使用flash软件将两条reads根据overlap合并成一条长reads；将得到的所述长reads的fastq文件转化为fasta格式的文件，使用cd-hit软件对转化后的所述fasta格式的文件内序列进行聚类，所述聚类结果为各个cluster的reads数以及各个cluster的代表性序列；

作为优选的技术方案，使用mafft软件将聚类结果中的各个cluster的代表性序列与目标区间进行序列进行两两比对。

作为优选的技术方案，所述步骤4)中筛选为筛选高频cluster与目标区间高频的突变位点。