[发明专利]一种氧化葡糖杆菌及其在生产古龙酸中的应用

说明书

本发明公开了一种氧化葡糖杆菌及其在生产古龙酸中的应用，属于生物技术领域。本发明采用ARTP诱变，最终筛选得到一株温度敏感型的氧化葡糖杆菌(G.oxydans)Nhu1209‑1。该菌株的酶活与原始菌株相比，提高了10～15％，发酵周期缩短了8～10h。此外，该菌株在山梨糖发酵结束后，可以在较低温度(45℃)和较短时间(20min)下实现彻底灭菌，不仅降低了能耗，同时也减少了对营养物质的破坏，有助于提高产酸量。

技术领域

本发明涉及一种氧化葡糖杆菌及其在生产古龙酸中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

维生素C(Vitamin C，简称VC)，即L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid)，是人体必须从外界摄入的一种水溶性维生素，在医药、食品、化妆品、饲料等领域应用广泛。2-酮基-L-古龙酸 (2-keto-L-gulonic acid，简称2-KGA)是合成维生素C的重要前体，目前“二步发酵法”依然是工业化生产VC的主要工艺。二步发酵法第一步是用氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans) 将D-山梨醇转化为L-山梨糖，然后用芽孢杆菌和普通生酮古龙酸菌混菌发酵，将山梨糖氧化为2-酮基-L-古龙酸，所获得的2-酮基-L-古龙酸通过酯化反应等步骤合成维生素C。在此工艺中，第一步发酵制得的含有山梨糖的发酵液，需要在60～80℃下灭菌30分钟以上，然后将灭菌后的发酵液作为二步发酵的培养基使用。这一过程能耗大，耗时长，对山梨糖的营养成分也有所破坏。

目前，也有为了降低能耗而不对发酵得到的含有山梨糖的发酵液灭菌，直接作为培养基使用，但第一步发酵中的氧化葡糖杆菌会随着含有山梨糖的发酵液进入第二步的发酵过程，并在第二步的发酵过程中消耗培养基中的营养物质，使得底物转化率显著降低，仅有 60％～80％，且转化率不稳定，与现有技术中灭菌的二步发酵法90％以上的转化率相比，存在一定的差距。

发明内容

为解决上述含有山梨糖的发酵液灭菌过程中存在的能耗大，耗时长，对发酵液的营养成分有所破坏等问题，本发明筛选获得了温度敏感型氧化葡糖杆菌菌株，适用于山梨糖低温灭菌过程。本发明的温度敏感型氧化葡糖杆菌菌株，能够在较低温度下实现彻底灭活，带来了以下优势：1.降低了低温灭菌过程中的能耗；2.降低了还原糖与有机氮高温条件下的复杂的副反应，从而降低了山梨糖发酵液中营养成分的破坏。

本发明的第一个目的是提供一株氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)Nhu1209-1，已于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.21196。

在本发明的一种实施方式中，所述菌株氧化葡糖杆菌Nhu1209-1的诱变筛选方法是：将出发菌株氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC No.17448，经ARTP诱变后，通过平板影印法最终筛选得到温度敏感型的目标菌株氧化葡糖杆菌Nhu1209-1。其具体步骤为：

(1)出发菌株活化：将保藏于甘油管中的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)CGMCC No.17448于固体培养基上划线，在25～37℃下培养10～20h，挑取单菌落于新鲜液体培养基，25～37℃培养8～24h后，按20～60mL/100mL接种量转接新鲜液体培养基，进行同步培养；

(2)ARTP诱变处理：将步骤(1)得到的菌液用新鲜的液体培养基稀释至OD₆₀₀为0.6～0.8 后，取5～15μL均匀涂于无菌载片上，在ARTP育种系统作用下开始诱变处理；

ARTP育种系统，所用气源为氦气，气体流量设定为15～45SLM(StandardLiterperMinute，公升/分钟)，功率为30～50W，处理时间为15-35s，照射距离为1～3mm。

(3)突变株的后培养：将诱变后的菌液均匀涂布于含有新鲜固体培养基的平板A上，30℃培养4～16h；