[发明专利]一种基于体外消化/Caco2

说明书

本发明提供了一种基于体外消化/Caco2细胞模型测定冬虫夏草中砷的生物可给性方法，属于重金属生物可给性检测技术领域。本发明采用transwell培养建立Caco‑2肠吸收模型，并通过体外模拟胃、肠消化的二步消化法建立体外消化/Caco‑2细胞模型，并采用ICP‑MS法测定冬虫夏草中砷的生物可给性，为科学、客观地评价中药中重金属的健康风险以及限量标准的制修定提供依据。实验证明，冬虫夏草中Caco‑2细胞转运后砷的生物可给性为1.5％～13.0％。本发明所述方法促进中药产业发展，节约资源，同时为客观、科学地评价中药中重金属对人体的健康风险提供新的思路，为制定科学、合理的重金属限量标准提供依据。

技术领域

本发明属于重金属生物可给性检测技术领域，具体涉及一种基于体外消化/Caco2细胞模型测定冬虫夏草中砷的生物可给性方法。

背景技术

中药中重金属的毒性评价不仅与其摄入的绝对量有关，更与实际被吸收而发挥作用的含量密切相关。若将中药中本身重金属的含量用于评估其风险，可能会高估其对人体的危害。重金属的生物可给性(bioaccessibility)，是重金属在胃肠环境中可以溶出的比例，是评价其最大经口生物利用度 (bioavailability)的指标。动物试验是评价重金属生物可给性最有效的手段，但是动物实验复杂繁琐、实验周期长、费用高。而体外模拟实验成本相对较低，试验结果可重复性好，且不受医学研究的伦理桎棝，因此被广泛应用于重金属的毒性评价。

体外模拟消化/肠道细胞模型是测定中药中重金属生物可给性的一种新的、有效的技术手段。将生物可给性视为经口的最大生物利用度既反映了机体暴露污染物的最坏情况，达到保护大多数人的目的，又可以为避免传统的评估中假设污染物全部被机体吸收，导致政府采取不必要干预措施。其中 Caco-2细胞来源于人体结肠腺癌细胞，其结构和生理生化功能与小肠上皮细胞相类似。Caco-2细胞培养后可形成紧密联结，并分化出绒毛面即肠腔室 (apical)和基底室(basolateral)即血液循环侧，同时能够表达小肠的多种转运体和代谢酶。因此，Caco-2细胞已被作为模拟小肠表皮细胞吸收过程的国际公认的体外模型。目前现有技术有报道采用体外消化/Caco2细胞模型评价场地土壤中重金属生物可给性/生物有效性及健康风险，发现在不同体外消化方法和不同消化阶段，土壤重金属生物可给性变化范围较大。然而场地土壤重金属污染与中药中重金属的存在形式、重金属种类以及重金属限量标准均有较大差异，并且中药的口服给药方式与场地土壤中重金属通过呼吸等方式摄入体内造成了生物可给性检测方法不同。目前还没有关于采用体外消化 /Caco2细胞模型评价中药中重金属的生物可给性方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于体外消化/Caco2细胞模型测定冬虫夏草中砷的生物可给性方法。

本发明提供了一种基于体外消化/Caco2细胞模型测定冬虫夏草中砷的生物可给性方法，包括以下步骤：

1)在厌氧条件下，将冬虫夏草粉末在模拟胃液中消化，得到胃消化液和残渣；

2)将所述残渣在模拟肠液中消化，得到肠道消化液；

3)吸弃Caco-2细胞模型的原有培养液，将所述肠道消化液加入到肠腔室中，将新鲜细胞培养液加入基底室，经细胞转化后，将得到的细胞培养液过膜，收集滤液进行电感耦合等离子体质谱分析，得到砷含量，计算砷的生物可给性。

优选的，步骤3)中Caco-2细胞模型的建立方法，包括以下步骤：

将Caco-2细胞培养生长融合至80％以上时，用含质量浓度0.25％胰酶的EDTA溶液消化，调整细胞密度至3×10⁵～5×10⁵·mL^-1，接种于Transwell 聚碳酸酯膜于24孔板中培养，待跨膜电阻大于200Ω·cm²时，得到Caco-2 细胞模型。