[发明专利]微流控芯片和温敏材料复合系统及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了微流控芯片和温敏材料复合系统及其制备方法和应用，所述系统以鱼骨形微流控芯片为骨架，并对芯片内部进行改造，改造后的微流控芯片内部负载有温敏材料，所述系统以细胞骨架相关蛋白4作为检测指标。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述系统能够快速准确的从血液中捕捉、分离循环肿瘤细胞，其捕捉效率高、特异性好，平均捕获率达95％以上；(2)所述系统对于已捕获的循环肿瘤细胞易于洗脱，便于后续的分析、培养，平均释放率达97％以上；(3)所述系统操作简便，重复性好。

技术领域

本发明属于生物医学及其检测技术领域，涉及一种新的用于捕捉/分离/分析血液中循环肿瘤细胞的系统，具体为微流控芯片和温敏材料复合系统及其制备方法和应用。

背景技术

循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)，是指自发或手术、放化疗后，由肿瘤或转移病灶释放，进入外周血循环的肿瘤细胞，在一定条件下可发展为转移性病灶，是癌症患者出现术后复发和转移的主要原因。临床研究证实，外周血中的肿瘤细胞数量越多，患者生存期越短。目前已有证据显示，外周血循环肿瘤细胞的数目可以成为实体瘤患者预后和化疗有效性的预测指标。在一些患者体内，循环肿瘤细胞可能长期存在，成为潜在的复发病灶。相对于在外周血大量存在的白细胞和红细胞，CTC在外周血的含量较少。因此，开发一种能高精度、高敏感度捕捉并能够有效释放CTC的方法对于后续的计数、分子功能分析都有重大意义。

目前对于CTC的捕捉主要可以分为两大类。一类是基于CTC与血液中其他细胞成分物理性质的不同，如密度、大小、表面所带电荷不同来实现CTC和其他血液成分的分离。但由于血细胞的大小分布不均一，癌细胞的大小也会随着肿瘤细胞来源不同而变化，因此根据物理性质进行分离所得的CTC纯度不高，对后续的分析会造成一定困难。另一类是基于CTC的表面特异性抗原，如上皮细胞抗原EpCAM，肿瘤特异性标志物(如PSA,CEA,HER-2等)。在这一类别中最具有代表性的是已被美国FDA批准的CellSearchTM系统，该系统应用标记EpCAM抗体的磁珠捕获CTC，可用于检测乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌患者外周血CTC。但该系统的捕获效率较低，较大程度存在血细胞的非特异性吸附，且所捕获的CTC已经失活，无法进行进一步的功能性分析和体外培养，并且常常存在假阳性和假阴性的问题。目前已有一些研究将微流控芯片与抗体捕获相结合增加了捕获细胞的几率，同时保留了细胞活性。但是这些方法也存在着一些问题，如白细胞的非特异性吸附，CTC与抗体结合后很难洗脱下来进行进一步分析等。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，构建一种能够快速准确的从血液中捕捉、分离循环肿瘤细胞的系统，且对所捕获的细胞易于洗脱释放，便于后续对细胞的分析、培养等操作，本发明提供了微流控芯片和温敏材料复合系统及其制备方法和应用。

技术方案：微流控芯片和温敏材料复合系统，所述系统以鱼骨形微流控芯片为骨架，并对芯片内部进行改造，改造后的微流控芯片内部负载有温敏材料，所述系统以细胞骨架相关蛋白4作为检测指标。

优选的，所述温敏材料为表面包被生物素-FITC和链霉亲和素的聚苯乙烯。

以上任一所述微流控芯片和温敏材料复合系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：

S1、将明胶溶液采用N-羟基磺酸基琥珀生物素(sulfo-NHS-Biotin)功能化，并将溶液pH调至7.4，37℃下反应；反应结束后置于蒸馏水中透析，然后制成冻干粉；

S2、在聚苯乙烯表面包被生物素-FITC和链霉亲和素，制成纳米粒；

S3、采用S1的明胶冻干粉对微流控芯片内部进行改造；

S4、将S2制得的聚苯乙烯纳米粒注入改造后的微流控芯片内；

S5、将细胞骨架相关蛋白4抗体注入S4所得的微流控芯片内，待抗体与芯片内表面结合后用PBS缓冲液洗去未结合抗体，即制得微流控芯片和温敏材料复合系统。