[发明专利]一种新城疫病毒及疫苗的无血清全悬浮培养制备方法

说明书

本发明属于兽用生物制品技术领域，公开了一种新城疫病毒及疫苗的无血清全悬浮培养制备方法。取MDCK细胞经复苏后加入到无血清培养基中进行悬浮培养，当细胞长至8.0×10⁶～16×10⁶cells/mL，活率在90％以上时，得到接种培养基质；将新城疫病毒接种至上述培养基质中，悬浮培养进行病毒吸附；然后补加无血清培养基的病毒生产液继续进行悬浮培养，得到新城疫病毒。本发明方法生产工艺稳定、易操作，病毒含量高、批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量，生产出的新城疫疫苗安全性好、免疫效力高，对新城疫强毒的攻击具有完全的免疫保护作用。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种新城疫病毒及疫苗的无血清全悬浮培养制备方法。

背景技术

目前，己上市的新城疫疫苗大多是通过传统的鸡胚培养制得，国内外使用鸡胚培养工艺生产新城疫病毒己有许多年的历史。虽然“鸡胚法”这种技术不断进化来应对各个挑战，包括产量、自动化、容量、质量保证和生长速度等方面。但在实际的生产过程中，由于SPF(无特异性病原)鸡胚供应量的制约以及成本问题，许多的国产疫苗并非全部由SPF鸡胚制造。尤其是禽用弱毒疫苗，若所有鸡胚来自普通鸡蛋，不仅可造成外源病原的污染，并由此造成了某些疫病的传播和蔓延。如需大批量繁殖新城疫病毒制备疫苗时，直接采用胚体进行病毒繁殖易受非免疫胚体来源限制，势必无法保证鸡胚来源、品种以及母源抗体水平的一致，继而对鸡胚的孵化率及其所繁殖病毒的效价造成很大影响，由于这些自然因素，造成的结果就是不同批次间的疫苗均一性很不稳定。同时鸡胚培养的病毒悬液中含有大量杂蛋白，在疫苗制备过程中存在一定的安全隐患，另外胚体废弃物往往高压灭菌并不彻底，也会存在散毒的危险，所以，利用鸡胚培养难以保证每批产品质量的一致性，稳定性及安全性，因此急需选择新的新城疫病毒疫苗生产介质。并且，新城疫病毒生产中一般用转瓶贴壁生长的方式培养，生产效率低成本高，在疫苗需求激增时会出现生产能力不足的问题。因此，选择一株能够大幅提高新城疫病毒的生长滴度并能大产量生产的细胞株显得尤为重要。目前已有报道用传代细胞系包括vero细胞系、marc-145细胞系、ST细胞系、BHK细胞系、MDBK细胞系以及鸡胚传代细胞DF-1细胞系来培养新城疫病毒制备疫苗，但是由于上述细胞表面新城疫病毒受体丰度低，造成病毒滴度低，形成蚀斑能力弱，并且大多使用血清培养，其价格非常昂贵，给进一步深入研究疫苗的制备造成极大困难。

专利CN 102978166 A公开了一种使用连续传代的细胞系制备新城疫病毒与疫苗的方法及其制品。将MDBK细胞系、VeroE6细胞系、BHK-21细胞系、PK-15细胞系、IBRS-2细胞系的任意一种或几种细胞系经消化传代，以细胞培养液进行培养，形成生长良好的细胞单层，然后将新城疫病毒接种于细胞单层进行病毒吸附，换用细胞维持液培养后加入D-氨基葡萄糖孵育，洗去孵育剂后重新加入细胞维持液培养细胞系以繁殖新城疫病毒。该专利虽然公开了采用无血清的细胞维持液进行病毒繁殖，但细胞生长所用的细胞培养液仍采用血清含量为1％-7％v/v的培养液，且为细胞贴壁培养，消化传代，并未实现新城疫病毒的无血清全悬浮培养与繁殖。

专利CN 110283791 A公开了一种培养新城疫、禽流感病毒并制备新流二联疫苗的方法。首先利用悬浮BHK-21细胞培养新城疫基因VII型病毒，使其收获抗原效价大于9；再利用悬浮MDCK细胞培养H9N2亚型禽流感病毒，使其收获抗原效价大于10；最后利用悬浮培养的新城疫基因VII型和H9N2亚型禽流感抗原制备新流二联疫苗。该专利虽然公开了采用无血清培养基培养新城疫基因VII型病毒，但采用的是BHK细胞系无血清培养基，且并未对新城疫病毒的生长与增殖的不同条件予以分开考虑。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种新城疫病毒的无血清全悬浮培养方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述方法培养得到的病毒在制备新城疫疫苗中的应用。