[发明专利]一种编辑M1AP基因的系统及其用途

说明书

本发明为一种编辑M1AP基因的系统及其用途，涉及M1AP基因的编辑，尤其是筛选到针对M1AP的敲除效率较高的sgRNA序列，其包含的间隔子序列如SEQ ID NO：14所示。

技术领域

本发明属于基因工程和基因遗传修饰技术领域，涉及基于CRISPR/Cas9技术的M1AP基因的编辑及其用途。

背景技术

M1AP也称为减数分裂1抑制蛋白，在细胞分化、染色体组装、雌配子产生、雄性减数分裂(减数分裂1期必需的物质)、染色体分离、RNA加工、精子形成等过程中均发挥重要调控作用。M1AP在睾丸、骨髓和其他8个组织中高表达，并且由于可变剪接形成多个转录本。尽管M1AP在雄性和雌性生殖系统中都有表达，但研究表明，它对雄性生殖细胞的发育至关重要，因为大多数缺乏M1AP的精母细胞在中期的粗线检查点或稍后的纺锤形检查点发生细胞凋亡。此外，研究还发现M1AP与神经肌肉疾病或急性髓系白血病有关，但其具体机制尚不清楚。

发明内容

目前，CRISPR技术作为一种新的基因组工程化工具，由于其操作简单，靶向精确，已被广泛应用于细胞的基因组编辑和免疫疗法的开发中。最常用的包括II型、V型、VI型等CRISPR系统。以II型CRISPR系统为例，在外源DNA入侵时，来自CRISPR重复阵列的转录物被Cas9和RNase III核酸酶加工为成熟的crRNA，随后与tracrRNA和Cas9组成复合体。通过识别PAM，crRNA将该复合体引导至靶标DNA，并通过crRNA包含的间隔区序列与靶DNA的结合，解开DNA双链，再由Cas9中的HNH结构域剪切crRNA的互补DNA链，RuvC结构域剪切非互补链，最终在靶标DNA处引入双链断裂。人们还发现，引导Cas9结合并切割特定的DNA序列不需要RNA复合物。通过使用设计的嵌合单向导RNA(sgRNA)可以简单地实现该过程。

术语“单向导RNA”或“sgRNA”是指通过将crRNA和tracrRNA分子融合成“单个向导RNA”的人工工程化RNA，当与Cas9蛋白结合时，其能够识别并切割向导RNA特异性的DNA靶标。sgRNA一般包含间隔子序列(spacer)和骨架序列，这两个序列可以在同一个分子中或不同的分子中。间隔子序列的作用是指导Cas9蛋白切割与间隔子序列互补的DNA位点，也即靶序列。一般而言，间隔子序列是与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交、并且指导CRISPR复合物与该靶序列特异性结合的任何多核苷酸序列。间隔子序列与其相应的靶序列之间的互补程度是约或多于约50％或更多。一般间隔子序列的长度为约20个核苷酸。骨架序列为sgRNA中必须的，除间隔子序列之外的其余序列，一般包含tracr序列和tracr配对序列，这些序列一般不会因为靶序列的变化而改变。由于骨架序列不影响sgRNA对靶序列的识别，因此，骨架序列可以是现有技术中任何可行的序列。骨架序列的结构可参见如文献Nowak et al.Nucleic AcidsResearch 2016.44:9555-9564。

在本文中可采用的骨架序列如下表1所示。

表1.示例性的sgRNA骨架序列

sgRNA，尤其是其中间隔子序列的设计需要考虑很多因素，例如长度、碱基组成、靶基因的结合位置、与非靶标位点的结合率、是否包含SNP、二级结构等等。目前已经可以通过各种在线工具来设计sgRNA。然而，由于Cas酶可以切割任何邻近PAM位点的靶序列，针对特定的靶基因而言，在线工具设计的大量sgRNA的编辑效率都不尽相同，甚至差异很大，例如，PAM位点是5'-NGG-3'的编辑效率通常就比5'-NGA-3'或5'-NAG-3'的高。因此，筛选特异性高的sgRNA对于CRISPR系统编辑效率的提高至关重要。

因此，在第一个方面，本发明提供一种靶向M1AP的sgRNA，其包含的间隔子序列如SEQ ID NO：14所示。

在一个优选的实施方案中，所述sgRNA还包含选自SEQ ID NO：1-12的骨架序列。