[发明专利]一种鸽嗉囊成纤维细胞的分离及原代培养方法

说明书

本发明提供了一种鸽嗉囊成纤维细胞分离及原代培养方法，包含以下步骤：取胚胎期鸽嗉囊组织，清洗后，将嗉囊组织剪成1mm³大小，均匀平铺细胞培养皿底部，加入少量FBS，置于细胞培养箱中6～8h后取出，加入完全培养基，继续培养，之后每隔2～3d更换一次培养基，培养5～7d即得到汇合度80％～90％的原代细胞。传代时使用提前预热至37℃的PBS清洗原代细胞后，加入胰蛋白酶消化，待细胞在显微镜下皱缩变圆时，加入完全培养基，终止消化，使用移液枪轻轻吹打细胞，转移至15ml离心管中，离心。重新加入完全培养基重悬细胞，按照1:2比例传代培养，置于细胞培养箱中进行培养，定时更换培养基。本发明所述原代分离方法操作简单，获得的细胞量大、纯度高，能够后续稳定培养。

技术领域

本发明涉及家禽嗉囊成纤维细胞离体培养技术领域，特别涉及一种鸽嗉囊成纤维细胞分离及原代培养方法。

背景技术

鸽嗉囊位于食管与肌胃之间的膨大部，具有湿润、贮存食物、提供免疫保护等功能，鸽嗉囊具有合成和分泌鸽乳能力。在孵化期，公鸽和母鸽嗉囊组织各细胞层开始大量增殖，为鸽乳的形成与积累提供保障。但目前的研究对于单种类细胞的分离及培养报道较少。鸽嗉囊成纤维细胞作为嗉囊组织的重要细胞群，据报道，成纤维细胞具有合成胶原纤维蛋白、粘连蛋白，以及分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维的能力，此外，成纤维细胞具有多向分化潜能，人类皮肤成纤维细胞经不同转录因子处理后，可转化为具有分化能力的多能干细胞，可转化为脂肪细胞、内皮细胞、软骨细胞、肌腱细胞以及神经细胞等。但鸽嗉囊成纤维细胞在孵化期快速增殖的机制、鸽乳生成过程中功能以及分化潜能尚不明确。因此，对嗉囊成纤维细胞进行分离及原代培养，建立嗉囊成纤维细胞培养的方法，用于各个领域实验研究显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸽原代嗉囊成纤维细胞分离与培养的新方法，以弥补鸽原代嗉囊成纤维细胞分离与培养方法的空白，为鸽嗉囊功能的研究与应用提供工具细胞。

为达到上述目的，本发明提供了一种鸽原代嗉囊成纤维细胞分离与培养的新方法，具体内容如下：

一方面，本发明提供了一种鸽嗉囊成纤维细胞分离方法，包括以下步骤：

无菌条件下取出胚胎期鸽的嗉囊组织，迅速放置含有10％三抗的PBS中；

用含有10％三抗的PBS清洗组织8～10次，去除周围结缔组织。

将组织剪成1mm³大小的组织块培养；

将组织块均匀平铺细胞培养皿底部，加入少量FBS，置于38℃，5％CO₂培养箱中6～8h后取出，加入完全培养基；

转移至细胞培养箱中继续培养，之后每隔2～3d再更换一次培养基，培养5～7d即得到汇合度80％～90％的细胞。

另一方面，本研究还提供了一种鸽嗉囊成纤维细胞的传代培养方法，包括以下步骤：

接种步骤5所述汇合度80％～90％的细胞；

去除培养基，使用提前预热至37℃的PBS清洗细胞2次

加入含EDTA的0.25％胰蛋白酶消化1min，显微镜下观察到细胞皱缩变圆时，立即加入完全培养基，终止消化；

用手轻轻拍打细胞培养皿，再使用移液枪轻轻吹打细胞。

消化完成的细胞转移至15ml离心管中，离心；

重新加入完全培养基重悬细胞，按照1:2比例传代培养，根据细胞生长情况更换培养基；

在以上技术方案的基础上，优选的，步骤1中所述胚胎期鸽的嗉囊组织为17日胚龄；

在以上技术方案的基础上，优选的，步骤1、4中所述三抗包括青霉素、链霉素和两性霉素；