[发明专利]一种鸽嗉囊成纤维细胞的分离及原代培养方法

权利要求书

1.一种鸽嗉囊成纤维细胞的分离方法，所述方法包括：

(1)无菌条件下取出胚胎期鸽的嗉囊组织，迅速放置含有10％三抗的PBS中；其中三抗为：青霉素、链霉素、两性霉素；

(2)用含有10％三抗的PBS清洗组织8～10次，去除周围结缔组织；

(3)将组织剪成1mm³大小的组织块培养；

(4)将组织块均匀平铺细胞培养皿底部，加入少量FBS，置于38℃，5％CO₂培养箱中6～8h后取出，加入完全培养基；所述完全培养基包含：89％DMEM高糖培养基，10％胎牛血清(FBS)和1％三抗；

(5)转移至细胞培养箱中继续培养，之后每隔2～3d再更换一次培养基，培养5～7d即得到汇合度80％～90％的贴壁细胞。

2.根据权利要求1所述的鸽嗉囊成纤维细胞的分离方法，其特征在于，所述胚胎期为17日胚龄。

3.一种鸽嗉囊成纤维细胞的传代培养方法，包括以下步骤：

(1)取权利要求1中步骤(5)中的汇合度80％～90％的贴壁细胞，显微镜观察后，可用于后续的传代培养；

(2)去除培养基，使用提前预处理PBS清洗细胞2次；

(3)加入适量预处理含EDTA的0.25％胰蛋白酶消化1min，显微镜下观察到细胞皱缩变圆时，立即加入完全培养基，终止消化；

(4)用手轻轻拍打细胞培养皿，再使用移液枪轻轻吹打细胞；

(5)消化完成的细胞转移至15ml离心管中，离心；

(6)重新加入完全培养基重悬细胞，按照1:2比例传代培养，根据细胞生长情况更换培养基。

4.根据权利要求3所述鸽嗉囊成纤维细胞的传代培养方法，其特征在于，步骤(2)中，PBS预处理具体步骤为：使用37℃金属浴预热PBS后，轻轻清洗细胞。

5.根据权利要求3所述鸽嗉囊成纤维细胞的传代培养方法，其特征在于，步骤(3)中，适量含EDTA的0.25％胰蛋白酶的量为刚刚没过培养皿底部。

6.根据权利要求3所述鸽嗉囊成纤维细胞的传代培养方法，其特征在于，步骤(3)中，预处理的含EDTA的0.25％胰蛋白酶预处理具体步骤为使用37℃金属浴预热含EDTA的0.25％胰蛋白酶后，再消化细胞。

7.根据权利要求3所述鸽嗉囊成纤维细胞的传代培养方法，其特征在于，步骤(3)中，消化1min时需在38℃，5％CO₂培养箱中进行。

8.根据权利要求3所述鸽嗉囊成纤维细胞的传代培养方法，其特征在于，步骤(5)中，离心要求为1000r/min，离心5min。