[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9的白桦基因编辑方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9的白桦基因编辑方法，以白桦中高度保守的BpPDS和BpUVR8为靶基因，在其保守结构域上分别选取了1个和4个靶位，共设计了5个靶序列，构造了pU3b‑sgRNA‑UBQ1‑Cas9转化载体。利用瞬时转染初步鉴定了5个靶序列与白桦基因组的适配度，稳定的农杆菌转化法被用于外源DNA的整合，初步说明BpPDS和BpUVR8‑1这两个靶位可以编辑白桦基因组；BpPDS与BpUVR8‑1稳定遗传转化的编辑效率分别为41.67％、100％，纯合单株的百分比分别为37.5％、100％。该方法的建立一方面，可用于初步鉴定载体的活性，筛选活性较大的靶位，提高转化效率；其次，可用于获得白桦CRISPR/Cas9突变体植株，方便生产规范化，对加快白桦功能基因的研究具有重要意义。

技术领域

本发明属于植物基因编辑技术领域，具体而言，是一种基于CRISPR/Cas9的白桦基因编辑方法。

背景技术

基因组编辑技术是一种现代的基因组修饰方法，按照脱氧核糖核酸酶的种类分为锌指核酸酶(ZFNs)、成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白系统(CRISPR/Cas)、转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)。CRISPR/Cas作为基因组编辑的后起之秀拥有先进的生物技术、技术复杂度相对较低、有针对性地高效编辑生物体基因组的显著优势而得到了研究人员的更多青睐。CRISPR/Cas系统主要有三种类型：Ⅰ型系统的Cas蛋白由6个亚型组成，Cas3、Cas5、Cas7也均参与crRNA的结合；Ⅱ型系统只存在于细菌中，且只需要Cas9这一种蛋白，不依赖多蛋白复合体；Ⅲ型系统主要存在于古菌，由Cas6和Cas10组成复合体，促进crRNA的转录与结合。CRISPR/Cas9系统凭借设计相对简单而被广泛开发利用，已成功对拟南芥、烟草、水稻、香蕉、玉米、大豆、西瓜和矮牵牛等模式植物和作物进行了可靠编辑，并有望凭借高效、精确修饰基因组的能力在植物分子育种、生物技术、农业、环境保护和基础植物生物学研究方面发挥巨大作用。

长期自然选择的过程中，细菌(宿主细胞)与病毒(外源核酸)相互博弈、协同进化催生了CRISPR/Cas9系统，其工作机理可归纳为3步：

(1)获取新间隔序列。当外源DNA入侵细菌时，其上的原间隔序列(protospacer)和3’位置的原间隔邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)被Cas9蛋白识别并整合到细菌自身基因组中，PAM序列通常由3-5个碱基组成，最常见的是NGG，这种PAM的复杂性与SpCas9蛋白构建体大小之间需要保持平衡，这也是SpCas9在各种背景下进行广泛测试的主要原因；

(2)CRISPR序列的转录与修饰。在前导序列的驱动下，CRISPR序列转录释放大分子前体crRNA(Pre-crRNA)和小分子反式激活RNA(tracrRNA)，在RNAseⅢ的作用下修饰剪切得到40bp左右的小分子crRNA，它们碱基互补整合组装成有编辑活性的sgRNA-Cas9复合体；

(3)靶向干扰。当外源DNA再次入侵细菌时，复合体上的sgRNA扫描外源DNA上的同源区段并与其互补，Cas9蛋白的HNH酶在PAM序列上游1-3碱基处，剪切与sgRNA互补的DNA单链，另一条非互补链在相应位置被Cas9的RuvC酶剪切(图1)，双链断裂(DSB)随后触发非同源末端连接(NHEJ)或者同源重组修复(HDR)，从而实现基因的定点编辑。