[发明专利]一种脐带间充质干细胞饲养上皮来源类器官的方法

说明书

本发明提供一种脐带间充质干细胞饲养上皮来源类器官的方法。在该方法中，上皮来源组织位于所述结构模式中心，并且按照从内向外的顺序所述上皮来源组织依次被第一凝胶层、第二凝胶层和第三凝胶层包覆，所述第三凝胶层被液体层包覆，并且在所述液体层中位于所述第三凝胶层下方为脐带间充质干细胞饲养层。本发明采用人脐带间充质干细胞作为饲养层以及上述结构模式培养类器官，一方面使得该培养体系中含有上皮来源(含肿瘤)类器官培养所需的最少组分，适用范围广，另一方面能够培养包括来源于正常上皮及实体瘤等多样本来源的组织，而且培养成功率较高。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞饲养上皮来源类器官的方法。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)是一类来源于发育早期中胚层及外胚层的多能干细胞，具有自我更新、多向分化的能力。目前研究的MSCs主要来源于成人骨髓以及脐带血。对于成人骨髓来源的间充质干细胞，由于其数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，且病毒感染率较高，加之供者的骨髓采集需进行骨髓穿刺术，故其获取受到一定的限制。近年来，有大量研究表明人脐带中也存在大量间充质干细胞，且具有来源广泛、取材方便、相对纯净、含量丰富及免疫原性低等优点，正逐渐取代其他来源的间充质干细胞成为MSCs研究领域的热点之一。

脐带是连于胚胎脐部与胎盘间的索状结构，外覆羊膜，内含来自中胚层的胶样结缔组织。大量研究证实脐带中含有丰富的间充质干细胞，其来源主要分四种：来源于Wharton’s jelly；来源于脐血管周围；来源于脐血；来源于脐静脉血管内皮下。由于人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)具有自身独特的优点和特性，有望成为细胞移植治疗各种疾病的良好细胞来源，其优点主要体现在以下几个方面：首先，hUCMSCs具有很强的粘附性，当进行低密度细胞培养时能迅速贴壁，且增殖速度快，在体外可被诱导为成骨细胞、成脂细胞、神经细胞等，具有多向分化潜能。其次，hUCMSCs不表达主要组织相容性复合物(MHC)II类抗原，且不表达或低表达多种移植免疫排斥相关的共刺激因子，如CD80、CD40、CD46、CD40L，是一类免疫缺陷细胞，其增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低。研究表明，分离后的脐带血淋巴细胞和单核细胞百分比分别为60.56％和17.93％，明显多于骨髓血46.75％和10.70％。分离后脐血干细胞的CD34、CD38明显多于骨髓血干细胞，分别为5.7:1.6和2.4:1.6。再者，分娩后的脐带属于废弃物，取材十分便利，且不受伦理道德方面的限制；最后，hUCMSCs的含量十分丰富，有研究表明一根30厘米长的脐带中可以分离培养得到107原代细胞，且细胞分化能力强，生物学性能稳定，多次传代后仍能保持较强的增殖及分化能力，为科研工作及临床治疗提供了充足的细胞来源。综上所述，由于脐带间充质干细胞在各方面都展现出强有力的优势，故在细胞治疗领域具有十分广阔的应用前景。

类器官(Organoid)是在体外用3D培养技术对干细胞或器官祖细胞进行诱导分化形成的在结构和功能上都类似目标器官或组织的三维细胞复合体，其具有稳定的表型和遗传学特征，能够在体外长期培养，它在形成过程中再现了体内器官发生的两个事件，即同类细胞以黏附的方式分类聚集和空间特异性的细胞谱系定型。与传统2D细胞培养模式相比，3D培养的类器官包含多种细胞类型，突破了细胞间单纯的物理接触联系，形成了更加紧密的细胞间生物通信，细胞间相互影响、诱导、反馈，协作发育并形成具有功能的迷你器官或组织，能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态，因而在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。

然而，传统的依赖于相继加入生长因子的3D培养技术培养哺乳动物干细胞来形成类器官的方法仍然有其局限性，比如其对类器官及它们的局部环境的控制不够精确，此外，该方法不能很好地复制器官发展过程中复杂又动态的微环境，从而难以获取更完整的类似体内器官发展的类器官。同时，体外培养环境与患者体内差异较大，缺乏完整的适合类器官生长增殖的细胞因子，使得类器官在培养过程中迅速衰老死亡，最终导致类器官培养成功率较低。因此，有必要继续探寻新的类器官制备技术。

发明内容