[发明专利]一种脐带间充质干细胞饲养上皮来源类器官的方法

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞饲养上皮来源类器官的方法，其特征在于：是利用一种结构模式进行培养，在该结构模式中，上皮来源组织位于所述结构模式中心，并且按照从内向外的顺序，所述上皮来源组织依次被第一凝胶层、第二凝胶层和第三凝胶层包覆，所述第三凝胶层被液体层包覆，并且在所述液体层中位于所述第三凝胶层下方为脐带间充质干细胞饲养层；所述方法包括以下步骤：

步骤1，制备脐带间充质干细胞饲养层；

步骤2，将上皮来源组织处理成细胞数量为3-50个细胞的细胞团；

步骤3，取三份凝胶培养基，第一份凝胶培养基重悬步骤2的细胞团得到细胞培养液；第二份凝胶培养基凝固成胶滴，具体方式为：将第二份凝胶培养基加至插入式细胞培养板中央，将该插入式细胞培养板于无菌、封闭、37℃、5％CO₂条件下倒置培养15-30min，凝固后即得；然后将所述细胞培养液加至所述胶滴上再进一步形成包含第一凝胶层和第二凝胶层的双层胶滴；第三份凝胶培养基加入所述双层胶滴上形成第三凝胶层；所述凝胶培养基为以下终浓度的组分：GIBCO血清替代物：5-30wt％；EW-7197-HCl：100-2000nM；SB 203580-HCl：1-40μM；Y-27632dihydrochloride：2-50μM；青霉素：100U/ml；链霉素：0.1mg/ml；Matrigel基质胶：3-6mg/ml，溶剂为DMEM/F-12培养基；

步骤4，在液体培养基中加入脐带间充质干细胞饲养层，再将步骤3的三层胶滴完全浸入该液体培养基中，并使三层胶滴位于所述饲养层上方，培养至类器官形成；所述液体培养基为以下终浓度的组分：GIBCO血清替代物：5-30wt％；EW-7197-HCl：100-2000nM；SB203580-HCl：1-40μM；Y-27632dihydrochloride：2-50μM；青霉素：100U/ml；链霉素：0.1mg/ml，溶剂为DMEM/F-12培养基。

2.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞饲养上皮来源类器官的方法，其特征在于：所述步骤1中制备脐带间充质干细胞饲养层的过程包括：将人脐带间充质干细胞接种后培养至细胞汇合度为40-60％，加入4-10μg/ml的丝裂霉素C，处理4-8h后去除丝裂霉素C，即得。

3.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞饲养上皮来源类器官的方法，其特征在于：所述步骤4中培养至类器官形成的控制条件为：于37℃、5％CO₂条件下培养4-7天，期间每隔2-3天更换一次液体培养基。