[发明专利]多样性抗体产生细胞的细胞库及其用途

说明书

本发明提供一种多样型抗体产生细胞的细胞库，所述细胞库中的抗体产生细胞的抗体基因包含多种抗体重链可变区的编码序列。其中，所述抗体重链可变区包含来自不同供体细胞的抗体重链可变区基因的重链V区段、重链D区段、或重链J区段，或其任意组合。本发明还提供扩展抗体产生细胞的细胞库多样性的方法、制备多样型抗体产生细胞的细胞库的方法和体外进化筛选生产具有抗原特异性活性的抗体的细胞的方法。

技术领域

本发明涉及抗体体外自发演化领域，具体涉及可体外演化的多样性抗体产生细胞的细胞库及其用途。

背景技术

获得性免疫系统是人体控制病原体的重要防御机制。这其中，抗体由于其在体内可以针对每个病原体进行针对性的优化并找寻到最具保护效应的分子而显得尤为重要。在病毒或其他微生物感染时，人体经过百万年的进化，发展出了一套在淋巴器官内对B细胞进行高效的分子演化，可以于数天内开发出针对感染源的特异性抗体，帮助个体抵御疾病。近30年，抗体的药用潜力在得到了巨大发展，已远远超越了简单的抗感染免疫。全球市场上销售额最高的前20种药物中，有几近一半是生物类药物。这其中抗体药物又是其中最重要的组成部分。尽管抗体药最早期往往是鼠源的，抗药抗体的严重问题推动整个领域经过长期技术改造发展为现今以人源化抗体为主流的构架。然而从鼠源抗体药物候选改造人员化的过程存在很大的不确定性，又消耗大量资源，人源抗体的筛选平台的探索在近20年是抗体生物制药业的一个重要研究课题。人源抗体噬菌体展示库，人源化小鼠和人外周血单细胞克隆技术都是这个方向的重要成果。

然而，由于原代B细胞无法在体外长期培养，更无法进行类似体内的受控基因组突变过程，至本发明前，抗体的高效的分子进化过程只能在生物体内完成，无法在体外有效的仿制。现有的所有人源抗体筛选技术也都以动物载体体内免疫，体外被动筛选为主，由于牵涉免疫原选择，免疫途径优化，动物血清筛选等多个步骤，研发周期长且无法适应快速应对大规模流行病类应用的需求。

B细胞定向突变与抗体基因所在的染色体环境有紧密关联但对基因序列本身的容忍性较高，因此，如果将一个外源基因嵌入到抗体基因可变区，该嵌入基因也可以通过B细胞高效的体细胞突变机制来进行分子演化。这些外源基因可以是单域抗体、非人源抗体基因，单链抗体，或药物受体等任何生物活性分子。

人源B细胞系Ramos是目前唯一一株可以在体外持续稳定的对抗体基因进行突变的细胞系。该细胞系是从成熟B细胞来源的淋巴细胞肿瘤中分离获得，表达重组后的3-23抗体重链基因，产生IgM抗体。通过3-4轮自然演化和定向筛选，该细胞被证明可以演化出针对链霉亲和素的特异抗体(Nature Biotechnology 20,1129-1134(2002))。然而，人体中抗体库多样性是分步完成的：从前-B细胞到成熟B细胞的VDJ重排是第二阶段感染中生发中心进行抗体基因体细胞高效突变产生抗病原微生物抗体的基础。Ramos细胞仅表达一个重组完全的重链抗体基因，从这个单一的VDJ重组源头出发，可针对的抗原种类也将受到极大限制。此外抗体功能与抗体恒定区亚型也有很大关联，因此如何将Ramos细胞应用于IgG抗体个亚型的筛选也是一个空白。

另一方面，由于Ramos细胞本身的抗体基因定向突变效率比体内B细胞在感染过程中的天然机理低约100倍，仅利用该细胞本身进行演化的效率低下，不能满足制药研发的需要。事实上，虽然B细胞在体内可以在7-14天内演化出针对未知抗原的高亲和力抗体，但未经改造的Ramos细胞在体外需要3-4个月才有可能得到类似产物。此外，为保持抗体库的多样性，抗体演化过程将不会丢弃任何细胞。这将使的演化抗体库在短时间内超过数十亿级的细胞，而对目的抗原高反应的抗体可能只有有限的数个。本领域不知晓何种技术平台可以高效分离扩增这样的高反应性单克隆细胞。

发明内容

本发明首次描述了在体外B细胞中进行抗体优化的系统，完成类似B细胞体内淋巴器官分子演化的过程，给予研究者体外模拟体液免疫反应过程的推演，极大加快功能性人源抗体的开发和利用。

本发明第一方面提供一种多样型抗体(Ig)产生细胞的细胞库，所述细胞库中的抗体产生细胞的抗体基因包含多种抗体重链可变区的编码序列。