[发明专利]一类融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及生物医药技术领域，具体是一类融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白，以及该类融合蛋白的制备方法及其在抗氧化方面的应用。本发明通过重组克隆，将TAT‑PTD的基因编码序列与海洋来源抗氧化蛋白编码序列拼接，构建PTD‑海洋来源抗氧化蛋白原核重组表达载体，将重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，筛选得到表达PTD‑海洋来源抗氧化蛋白的重组菌株，诱导表达后利用亲和层析法纯化获得融合蛋白，方法简单，价格低廉。本发明涉及的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白具有高效的跨膜能力及显著的抗氧化活性，能有效解决蛋白多肽等生物大分子跨膜困难的问题，可应用于抗氧化药物、抗辐射药物、皮肤防护剂的开发。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一类融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白，该类蛋白的制备方法及其在研制抗氧化、抗辐射等药剂中的应用。

背景技术

海洋是一个高渗、高压、高紫外辐射的特殊环境，其独特的生态环境赋予海洋生物更多高效的生物活性物质，包括抗菌肽、抗氧化蛋白等具有良好开发前景的新功能蛋白。海洋浮游生物生活于4-6米深的海水表层，长期生活在强烈的光辐射环境下。氧化损伤是紫外辐射造成机体损伤的重要机制之一，已有研究表明，浮游生物为避免或减少紫外辐射造成的损害，经过长期适应性选择，在其机体内产生了种类繁多、结构特异、活性强烈的抗氧化活性物质。发达的抗氧化体系在保护细胞和生物体免受紫外辐射损伤中起重要作用，能抵御强紫外线对生物体的辐射，清除辐射所致的自由基。

水母是一种非常典型的海洋浮游生物，我们前期通过发形霞水母触手cDNA文库筛选、重组表达和分离纯化等一系列基因工程技术，获得了一系列高纯度水母来源的抗氧化蛋白，包括发形霞水母硫氧还蛋白(CcTrx1)、发形霞水母过氧化物还原酶(CcPrx4)、发形霞水母超氧化物歧化酶(CcSOD1)。研究发现它们都具有显著的抗氧化活性。尽管如此，由于细胞膜的保护作用，蛋白多肽等生物大分子很难直接进入细胞发挥作用，而机体的氧化损伤主要在细胞内产生，这就极大地限制了海洋来源抗氧化蛋白在抗氧化、抗辐射等药物研制中的应用。

蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)，又称细胞穿膜肽，是一类含有5-30个氨基酸残基的短肽，富含碱性氨基酸，能有效引导与之连接的蛋白和多肽进入细胞，转导速度快，效率高，不影响蛋白和多肽本身的活性，且对细胞无毒性。细胞穿膜肽的低毒性和高穿膜效率，使其在辅助蛋白多肽等生物大分子进入细胞的过程中扮演重要角色，具有非常好的应用前景。

目前，国内外尚无对穿膜肽与海洋来源抗氧化蛋白融合表达的相关研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白及其制备方法。

所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白的制备方法：是根据穿膜肽的氨基酸序列，设计其基因编码序列；通过化学合成法获得融合表达穿膜肽与海洋来源抗氧化蛋白的基因编码序列，利用两个酶切位点将融合编码序列连接到pET24a载体上，构建原核重组表达载体；在大肠杆菌中诱导表达后利用亲和层析的方法进行纯化，得到高纯度融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白，即PTD-海洋来源抗氧化蛋白。该方法实施简单，成本低廉，能够使海洋来源抗氧化蛋白高效进入细胞内发挥抗氧化作用。活性检测发现，上述方法获得的融合蛋白具有高效的跨膜能力和显著的抗氧化活性。

本发明的另一目的在于提供一种上述融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白在抗氧化药物、抗辐射药物、皮肤防护剂等研制中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：