[发明专利]一种伯克霍尔德菌及其应用

说明书

本发明涉及微生物领域，具体是一种伯克霍尔德菌及其应用。首先经初筛，将样品菌悬液稀释涂布平板，挑取单菌落，以瓦伦西亚烯为唯一碳源，通过绘制生长曲线进行初筛，选择生长良好的菌株进行下一步实验；再经过复筛，将菌种对瓦伦西亚烯生物转化生成圆柚酮的产量进行分析比较，选择圆柚酮产量高的菌株进行下一步实验；对选择出的菌株进行划线分离，将菌种对瓦伦西亚烯生物转化的产物及含量进行分析测定。与现有的物理、化学合成法相比，具有高度专一性、反应条件温和、反应速率快、收率高、成本低及反应步骤少等特点，且这样生产的圆柚酮属于天然香料，可以添加到食品、化妆品及其他家用产品中。

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体是一种伯克霍尔德菌及其应用。

背景技术

圆柚酮是柚类香气成分中重要的物质之一，其具有持久强烈的柑橘味香味，主要作为香料添加在食品和化妆品中。在香烟中添加一定量的圆柚酮，能够增加卷烟香气，丰满卷烟香味，降低刺激；圆柚酮带有甜的果皮、木香香韵，因此也可用于调配柚子、橙子、热带水果等食用香精。

天然圆柚酮主要存在于香柠檬油、圆柚油、柠檬油、柑橘油、白柠檬油和红橘油等挥发油中。但其在精油中的天然含量一般较低，因而实际生产使用的圆柚酮主要来源于化学合成。最常见的合成方法是使用瓦伦西亚烯作为起始物质，使用重铬酸盐氧化瓦伦西亚烯，或在叔丁基过氧化氢(TBHP)存在下使用催化剂进行氧化。这些化学合成方法大量使用了重金属催化剂，对环境有严重的破坏，其他一些能够使用的非重金属催化剂虽然不会破坏环境，但都有着较大的安全隐患，并且生产效率过低，无法适应生产的需求。

欧洲食品法规有明确规定，采用化学合成方法得到的圆柚酮产品不能作为一种天然香料进行销售和使用，天然香料只能由物理过程(从天然原料中萃取) 或酶/微生物工艺来制备。微生物转化是通过微生物细胞或酶对外源性底物进行结构修饰，也就是利用微生物代谢过程中产生的某个或某一系列酶对底物进行的催化反应，因此通过微生物转化生产的香料也属于天然香料。微生物转化具有高度专一性、反应条件温和、反应速率快、收率高、成本低及反应步骤少等特点。目前已被广泛用于有机合成、新药开发、体外代谢产物预测、香料生产等方面。

发明内容

本发明的目的是采用以瓦伦西亚烯为唯一碳源的筛选方法，高效准确地筛选出能够转化圆柚酮的菌株，将自然界中含量丰富、应用价值不高的瓦伦西亚烯转化生产为香气更浓、应用更为广泛、商业价值更高的天然香料圆柚酮。

为实现上述发明目的，本发明提供一种伯克霍尔德菌，保藏编号为CCTCCNO：M2020510，其筛选方法如下：

(1)从湖北省柑橘工程技术研究中心取10g土样，将土样加到90g的灭菌生理盐水中，混匀。

(2)取2mL混匀的液体于100mL最小培养基中，并添加1mL瓦伦西亚烯(0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存)，37℃，121r/min震荡培养2-7天。

(3)将(2)获得的菌液用灭菌后的生理盐水稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、 10^-5和10^-6共6个稀释梯度，将各个梯度菌液涂布平板分离菌种，37℃培养直至菌落完全生长。

(4)待(3)中菌落长出后，选择适宜浓度的平板挑取单菌落，将单菌落接种于LB培养基中活化培养。

(5)初筛：取适量活化培养的菌液于最小培养基中，并添加1％瓦伦西亚橘烯(0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存)，37℃，210r/min下培养，每隔 12h测一次菌液OD₆₀₀值，绘制菌株的生长曲线。

(6)根据(5)绘制的生长曲线，选取生长良好的菌株转接至LB培养基中活化培养。