[发明专利]柱锈菌科特异性引物筛查方法

说明书

本发明公开了柱锈菌科特异性引物筛查方法。本发明提供了特异引物对和探针Cro‑P；所述特异引物对由引物Cro‑F和引物Cro‑R组成；所述引物Cro‑F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；所述引物Cro‑R为序列表的序列2所示的单链DNA分子；所述探针Cro‑P为序列表的序列3所示的单链DNA分子；本发明对于有效监测柱锈菌科的高危病原真菌的跨境传播，提高口岸检疫部门的检测以及防控能力具有重大的应用推广价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及柱锈菌科特异性引物筛查方法。

背景技术

引起危害世界林木的三大真菌病害之一的松疱锈病的病原物由植物病原真菌柱锈菌科的物种组成。该科物种属于真菌界担子菌门(Basidimycota)，柄锈菌纲(Pucciniomycetes)，柄锈菌目(Pucciniales)的柱锈菌科(Cronartiaceae)科内。该科原有两属，柱锈菌属(Cronartium)和内柱锈菌属(Endocronartium)。目前柱锈菌科内柱锈菌属划归于柱锈菌属内，该科新增了拟膨痂锈菌属(Quasipucciniastrum)。其中，全球重要的检疫性物种都在柱锈菌属内。该类病害对人工或自然松林威胁严重，一旦成灾就会造成巨大的经济损失和生态破坏。该类病害主要发生于红松、华山松等五针松类，同时也危害油松、樟子松、黑松、赤松、马尾松、黄山松、高山松、美国黄松等重要的两针松类，可引起松树溃疡、肿瘤，最终导致树木生长不良甚至整株枯死。我国东北三省、秦岭地区以及云、贵、川等地区的天然林和人工林是该类病害的重灾区，发病严重的林区平均病株率高达40％，感病松树主梢生长量可减少82％～94％，严重影响松树生长。近年来，随着人工松林的大面积栽植，该类病害在国内外有逐年扩大和加重的趋势。该属内绝大多数物种对松树有很大的危害，其中一些种已列入各国重点检疫对象。在欧洲，隶属于柱锈菌属的检疫物种有5种。在我国也有5种作为进境检疫对象。由于该类群真菌具有复杂的生活史、广泛的寄主范围、形态各异的五种孢子阶段(性孢子、锈孢子、夏孢子、冬孢子及担孢子)以及转主寄生性等特点，常规筛查鉴定比较困难。柱锈菌科内的物种其性孢子阶段和锈孢子阶段寄生在松树上，而夏孢子阶段和冬孢子阶段主要寄生于双子叶植物的八个科，即虎耳草科(Saxifagaceae)，玄参科(Scrophulariaceae)，萝藦科(Asclepiadaceae)，龙胆科(Gentianaceae)，芍药科(Paeoniaceae)，壳斗科(Fagaceae)，杨梅科(Myricaceae)和檀香科(Santalaceae)。

在我国，根据农业部2007年5月29日发布的第862号公告《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，柱锈菌科内共计有6种检疫性真菌，包括油松疱锈病菌(C.coleosporioides Arthur)、北美松疱锈病菌(C.comandrae Peck)、松球果锈病菌(C.conigenum(Pat.)Hedgc.N.R.Hunt)、松纺锤瘤锈病菌(C.fusiforme Hedgc.N.R.Huntex Cummins)、松疱锈病菌(C.ribicola A.Dietr.)以及松瘤锈病菌(C.harknessii,synonym of Endocronartium harknessii(J.P.Moore)Hirats.)。这些真菌引起松疱锈病是与板栗疫病和榆树枯萎病并列的危害世界林木的三大真菌病害之一，对人工或天然松林的威胁非常大。由于该类群真菌寄生在松树和双子叶植物的八个科的150余种植物上，生活史复杂、寄主范围广、不同孢子阶段(性孢子、锈孢子、夏孢子、冬孢子及担孢子)形态各异以及转主寄生性等特点，常规筛查鉴定比较困难。由于相关寄主、转主植物进出口比较频繁，现有的检测方法都以形态检测为主，都具有检测局限性，并不能准确地检测出一种柱锈菌科及其内部检疫性物种普适性较差，在检疫性鉴定应用方面存在缺陷，不能满足口岸日常检测筛查的需要。

发明内容