[发明专利]一种在大肠杆菌中表达的有机磷水解酶基因组及其应用

说明书

一种在大肠杆菌中表达的有机磷水解酶基因组及其应用，包括源于黄杆菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的OpdS基因、源于假单胞菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑6所示，优化后获得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因分别与T7启动子和终止子融合，构建对应的基因表达盒，再连接入大肠杆菌表达载体，并转化至大肠杆菌，在大肠杆菌中成功表达，获得的阳性菌株对有机磷农药甲基对硫磷和甲基对氧磷具有良好的降解作用。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种在大肠杆菌中表达的有机磷水解酶基因组及其应用。

背景技术

现代农业生产中，农药在保证农业生产中有着不可估量的作用。使用最多的有机农药主要是有机氯农药和有机磷农药。但是，自20世纪60年代以来，许多国家开始禁止或限制使用有机氯农药。因此，高效、低成本的有机磷农药作为有机氯的替代农药而迅速在国内外大量生产和使用，并发展为目前应用最广、品种最多的农药之一。

有机磷农药，通常是指磷酸酯或硫代磷酸酯类有机化合物。甲基对硫磷是有机磷农药中的其中一种较为常见的杀虫剂，被广泛用于防治水稻、棉花、果树、茶叶、蔬菜等害虫。由于其具有高毒性的特点，我国已于2007年起禁止在农业范围使用，但仍保留部分企业出口生产的能力。虽然已停止甲基对硫磷的使用，但由于其在环境中残留仍然比较严重，并且部分地区仍有禁而不止的现象发生，故有机磷杀虫剂的残留污染问题认识目前亟待解决的严重问题之一。

微生物具有极强的变异性和适应性等特点，成为了自然环境中降解有机磷农药的主要成员。目前，已分离出的能降解有机磷的微生物有细菌、放线菌、真菌、藻类等。

微生物对甲基对硫磷和甲基对氧磷的代谢，初始反应一般为水解反应，即在水解酶的作用下一个磷硫酯键断裂，生成一种无毒化合物和对硝基苯酚PNP。PNP的毒性虽与母体相比下降了100倍，但由于其含有苯环结构，残留时间很长，对环境和人类的毒性也很大。目前已分离出的一些能够降解甲基对硫磷的细菌和真菌，并不能继续降解PNP。因此，需要寻求另一种方法来实现甲基对硫磷的完全降解。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在大肠杆菌中表达的有机磷水解酶基因组及其应用，利用合成生物学技术将不同来源的基因片段进行设计、改造，将完整的异源分解代谢途径引入到大肠杆菌中，从而使大肠杆菌具备降解和耐受甲基对硫磷、甲基对氧磷的功能，提高细菌对有机磷农药的降解效率和耐受能力，丰富工业应用降解菌资源。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种在大肠杆菌中表达的有机磷水解酶基因组，包括源于黄杆菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的OpdS基因、源于假单胞菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因。

进一步，按大肠杆菌的密码子偏好性优化后，所述OpdS基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示；PnpAS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；PnpBS基因的核苷酸序列如SEQID No.3所示；PnpCS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；PnpDS基因的核苷酸序列如SEQID No.5所示；PnpES基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明提供所述有机磷农药的基因组合在大肠杆菌中的应用。

一种多基因大肠杆菌转化载体，包括大肠杆菌表达载体，以及源于黄杆菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的OpdS基因、源于假单胞菌并按大肠杆菌的密码子偏好性优化后获得的PnpAS、PnpBS、PnpCS、PnpDS和PnpES基因分别与T7启动子和终止子融合的基因表达盒。

优选地，所述大肠杆菌表达载体为pET-28a。