[发明专利]高产血红素的重组质粒和基因工程菌株及其构建方法、高产血红素的方法

说明书

本发明涉及代谢工程领域，特别涉及高产血红素的重组质粒和基因工程菌株及其构建方法、高产血红素的方法。该重组质粒包括如下基因：hemA、hemL、hemB1、hemB2、hemC、hemD、hemE、hemN、hemG1、hemG2、hemG3、hemH1、hemH2和ccmf。本发明利用了代谢工程和合成生物学手段对S.oneidensis MR‑1进行改造，从而高效的合成血红素。将这种方法应用于电活性细菌的工程化改造将有助于这类细菌在精细化学品生产中的应用。

技术领域

本发明涉及代谢工程领域，特别涉及高产血红素的重组质粒和基因工程菌株及其构建方法、高产血红素的方法。

背景技术

目前血红素的生产主要是利用有机萃取或酶促水解从生物样品(例如植物组织和动物血液)中分离游离血红素，不仅过程复杂、产量低、耗时而且会造成污染问题。代谢工程技术的发展为利用微生物细胞工程生产血红素提供了契机。

电活性细菌进化出了独特的胞外电子传递方式用以在厌氧环境中利用多种电子受体完成细胞呼吸代谢过程。该类微生物也因此在能量回收、化学品生产、环境修复等方面具有重要作用。迄今为止，人们从环境中分离出多种异化金属还原细菌，如Shewanellaspp.,Geobacter spp.,Pseudomonas spp.,Listeria spp.，并对其胞外电子传递通路进行了表征。作为一株模式异化金属还原细菌，Shewanella oneidensis MR-1受到人们的广泛关注。它利用一个复杂的胞外电子传递网络将胞内代谢产生的电子传递到胞外电子受体。具体步骤为：该菌首先将胞内L-乳酸氧化分解产生的电子汇聚到NADH池，随后电子通过醌池到达内膜和周质中的多种氧化还原终端酶或者外膜上的孔蛋白-细胞色素复合体(OmcA-MtrCAB)，并最终通过直接和间接的方式传递到胞外电子受体。电活性细菌独特的胞外电子传递特性为利用微生物电化学系统(MES)电合成生产血红素提供了可能。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了高产血红素的重组质粒和基因工程菌株及其构建方法、高产血红素的方法。本发明提供的高产血红素的质粒系统和宿主体系，用于实现血红素的高效和放大生产。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种高产血红素的重组质粒，所述重组质粒包括如下基因：hemA、hemL、hemB1、hemB2、hemC、hemD、hemE、hemN、hemG1、hemG2、hemG3、hemH1、hemH2和ccmf。

作为优选，hemA、hemL、hemB1、hemB2、hemC、hemD、hemE、hemN、hemG1、hemG2、hemG3、hemH1、hemH2和ccmf的基因来源为E.coli MG1655。

作为优选，重组质粒的质粒载体为pBF-PTetO。

作为优选，质粒载体的序列如SEQ ID NO：1所示。

作为优选，重组质粒的序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了该重组质粒的构建方法，包括如下步骤：

以质粒载体为模板，扩增得到质粒骨架；

将基因hemA、hemL、hemB1、hemB2的DNA片段与质粒骨架进行组装，得到质粒-HE1；

将基因hemC、hemD、hemE、hemN的DNA片段与质粒骨架进行组装，得到质粒-HE2；

将基因hemG1、hemG2、hemG3、hemH1、hemH2的DNA片段与质粒骨架进行组装，得到质粒-HE3；

将基因ccmF与质粒骨架进行组装，得到质粒-HE4；