[发明专利]一种评价促血小板生成素受体激动剂受体亲和力的方法

说明书

本发明提供了一种评价促血小板生成素受体激动剂（TMP‑Fc）受体亲和力的分析方法，其过程包括以下步骤：捕获分子的偶联固定，样品捕获，系列浓度梯度的TPOR受体作为分析物进样分析，数据进行多循环动力学亲和力拟合分析。本发明既避免了直接偶联单价物作为配体，多价物作为分析物而发生的舞蹈效应，也克服了直接偶联样品导致有效活性浓度不同所引起的数据差异。此方法确保了药物有效浓度的一致性，进而提高了评价促血小板生成素受体激动剂（TMP‑Fc）受体亲和力的分析方法的准确性和重复性。

技术领域

本发明涉及蛋白质医药生物工程与技术领域，涉及一种促血小板生成素受体激动剂（TMP-Fc） 体外受体亲和力的检测方法。

背景技术

免疫性血小板减少症（ITP）是一种罕见的、严重的自身免疫性疾病，以体液免疫和细胞免疫介导的血小板过度破坏和巨核细胞成熟障碍为特征的获得性出血性疾病，约占出血性疾病总数的1/3。

促血小板生成素受体（c-Mpl）激动剂特异性与TPO受体结合，通过促进巨核细胞增殖发育而产生血小板，通常用于治疗化疗引起的血小板减少或血小板减少性紫癜。

罗米司亭（TPO模拟肽-Fc融合蛋白）为一种新型重组蛋白，属于第二代TPO受体激动剂，是一种长效TPO受体激动剂。该蛋白是在抗体Fc片段羧基端连接了两段TPO模拟肽，该模拟肽可以与TPO受体特异结合，诱导骨髓中的造血干细胞分化为巨核细胞，并促进巨核细胞的生长、成熟和分化，使巨核细胞最终释放血小板。 其用于免疫性血小板减少性紫癜的二线治疗，并具有起效快、给药频率低、安全性更优等特点。

药物与靶蛋白的亲和力分析是药物活性分析评价最重要的质量属性之一，能够客观的反应药物与靶蛋白的结合和解离速率。表面等离子共振(Surface PlasmonResonance, SPR）技术是生物分子间相互作用研究使用的关键技术，能够提供实时、完整、全面的分子互作过程信号和相关数据来揭示蛋白质之间的相互作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种使用SPR技术稳定的评价促血小板生成素受体激动剂受体亲和力的分析方法。目前已知的使用SPR技术来评价TMP-Fc融合蛋白受体亲和力的方法是使用化学试剂将CM5芯片表面的羧基活化后，将融合蛋白注入，使融合蛋白氨基酸上的氨基直接与芯片表面活化后的羧基进行缩合反应，从而将样品偶联在CM5芯片上的直接法。该方法进行共价偶联时，融合蛋白上参与反应的氨基是随机的，如果活性区域的氨基参与偶联，将导致重组蛋白的有效活性丢失。相同样品在同等的偶联量下，每次偶联后的重组蛋白有效活性浓度会有差别，导致同样条件的亲和力分析得到的信号值差异很大，拟合得到的亲和力数据差异大，结果重复性差且不可信。

鉴于以上原因，本发明使用一种捕获蛋白对TMP-Fc融合蛋白的非受体结合活性区域进行捕获，从而确保了捕获的蛋白分子具有有效活性。并通过控制捕获条件来保证捕获量的稳定性，也就克服了直接偶联的传统方法，偶联有效药物浓度不可重复性的问题，此检测方法稳定性好，成本低，重复性高。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种评价促血小板生成素受体激动剂（TMP-Fc）受体亲和力的分析方法，该方法是使用捕获法对TMP-Fc进行捕获，具体的是使用捕获蛋白对TMP-Fc融合蛋白的非受体结合活性区域进行捕获，其中所述的捕获蛋白可识别并结合抗体Fc片段，例如 Protein A。

进一步本发明所述的捕获法就是使用Protein A对TMP-Fc融合蛋白的非受体结合活性区域即Fc片段进行捕获，从而对TMP-Fc蛋白进行亲和力分析。

本发明所述的分析方法，其中捕获法包括固定捕获分子和捕获配体，其中在固体捕获分子过程中参比通道和配体通道全部使用氨基偶联的方法固定捕获分子；具体步骤如下：

（1）固定捕获分子：将芯片的参比通道和配体通道全部使用氨基偶联的方法固定捕获分子Protein A;