[发明专利]一种枇杷原生质体的分离方法

说明书

本发明提供一种提高枇杷幼苗抵抗干旱或/和寒冷胁迫能力的方法，在枇杷幼苗遭受干旱或/和寒冷胁迫前采用特定浓度的褪黑素溶液浇灌处理，结果表明：褪黑素处理显著提高了枇杷幼苗叶片中的内源褪黑素含量和荧光参数；显著增强了枇杷幼苗叶片内的SOD、POD、CAT、APX含量，同时降低了MDA含量，以及维持叶片组织结构的完整性。研究发现，特定浓度的褪黑素溶液不仅可以提高枇杷幼苗抵抗干旱胁迫能力，还可以提高枇杷幼苗抵抗寒冷胁迫能力，种植过程投入成本低，幼苗的成活率高，从而有助于提高新品种推广的速度和效率以及提高杂交育种过程中的后代的成活率，加速育成新品种的进程和效率，对我国枇杷产业的可持续发展具有重要战略意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及酶解制备枇杷原生质体的研究，具体涉及一种枇杷原生质体的分离方法。

背景技术

枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)是蔷薇科、枇杷属植物，是多年生木本常绿小乔木，高可达10米；小枝粗壮，黄褐色，密生锈色或灰棕色绒毛。枇杷起源于我国，已有上千年的栽培历史。它的果实成熟于春末夏初的水果淡季，是我国重要的经济果树。当前枇杷主要通过自然选种及有性杂交筛选后代等传统方法进行育种，这种方式耗时长且成功率较低。随着生物技术的日益成熟，结合基因组学、分子生物学的生物技术育种逐渐打破一些常规育种的局限而成为新的育种方式。然而枇杷目前仍没有建立高效稳定的遗传体系，这直接阻碍了生物技术育种及功能基因组学等的发展。

原生质体是细胞壁以内各种结构的总称，也是组成细胞的一个形态结构单位，细胞中各种代谢活动均在此进行。原生质体包括细胞膜、细胞质、细胞核和细胞器等。原生质体化学成分十分复杂，其组分也随着细胞新陈代谢活动在不断变化，相对成分比例为水85％～90％，蛋白质7％～10％，脂类物1％～2％，其他有机物(包括核酸)1％～1.5％，无机物1％-1.5％。其中蛋白质与核酸为主的复合物，是与生命活动相关最主要的成分。原生质体相比于含有细胞壁的细胞而言，不仅可以保持细胞的全能性，而且更容易接受外源的遗传物质，使外源DNA在植物原生质体中快速表达。枇杷原生质体的成功分离，是枇杷进一步利用遗传转化进行功能基因研究、细胞融合进行种质资源创制和细胞无性系选育等方面的研究及应用迈出的第一步。

现有的原生质体分离方法主要包括机械分离法和酶解法。机械分离法是指将细胞放进高渗糖溶液中进行处理，使细胞发生一定程度的质壁分离，研磨或切割相应的植物组织，从而使原生质体从伤口处释放。其操作费时费力，原生质体产量低下，并且其分离材料只局限于高度液泡化的细胞，因而使用受到很大的限制。酶解法是通过生物酶分解细胞壁的纤维素及细胞间隙的果胶等成分，从而释放出原生质体。在现有技术披露的枇杷原生质体的研究中，多采用愈伤组织或悬浮培养物为起始原料培养原生质体(参见林顺权等人的文章“枇杷原生质体培养形成愈伤组织”，福建农学院学报，20(2):179-184,1991；林庆良等人的文章“栋叶枇杷原生质体的分离与培养”，福建农业大学学报，23(l):26-29,1994)。这些方法对材料要进行特殊处理，先获得愈伤组织或悬浮培养物，然后通过酶解分离得到枇杷原生质体，方法取材不够便捷，且工艺较为复杂。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种枇杷原生质体的分离方法，该方法以枇杷叶片为材料，样品取材方便，不需要对材料进行特殊处理；同时酶解过程只需要纤维素酶和离析酶两种酶制剂，酶液配制简单；不需要繁琐的试验步骤，一步即可获取数量可观的原生质体。

除特殊说明外，本发明所述百分比均为质量百分比。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：