[发明专利]一种定量检测抗除草剂蛋白PAT/pat的酶联免疫试剂盒

说明书

一种定量检测抗除草剂蛋白PAT/pat的酶联免疫试剂盒，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成，本发明试剂盒成本低，主要试剂均以工作液形式提供，操作简便，能同时快速检测大批样品；具有高灵敏度、高特异性的特点；是目前国内乃至国际首个能定量特异检测转基因玉米中抗除草剂蛋白PAT/pat的试剂盒。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种定量检测抗除草剂蛋白PAT/pat的酶联免疫试剂盒。

背景技术

转有抗除草剂基因作物的种植，使在田间喷洒除草剂成为有效防除杂草方式，也因而使抗除草剂性状成为农业生产中最具优势的性状之一。目前，抗除草剂作物占全球转基因作物的80％以上。从发展趋势上看，转基因的作物比例仍在不断增加。

链霉菌(streptomyces)中PAT/pat基因表达的蛋白在乙酰辅酶A存在的情况下能催化乙酰辅酶A与除草剂草铵膦的游离氨基结合，使L-草铵膦变为乙酰-L-草铵膦，从而使除草剂失活，赋予转基因作物抗除草剂特性。PAT/pat基因作为遗传转化中的标记基因广泛应用于基因工程育种中。

随着转基因作物的飞速发展带来巨大经济利益的同时，人们也越来越关注转基因作物可能带来的不可预期的食用安全及环境安全性问题。因此建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物的安全管理，保障人、动物以及微生物的安全，能够保护生态环境。为了对转基因玉米或者其衍生物中PAT/pat蛋白进行快速的定量或定性分析，研究并得到抗除草剂PAT/pat蛋白的单克隆抗体具有非常大的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定量检测抗除草剂蛋白PAT/pat的酶联免疫试剂盒，该酶联免疫试剂盒可以定量检测转基因玉米中抗除草剂蛋白PAT/pat。

本发明提供的定量检测转基因玉米中抗除草剂蛋白PAT/pat的酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成。

其中，样品处理液的配方为：

生物素标记的检测抗体：100μg/mL生物素标记的PAT/pat单抗杂交瘤细胞株PA1-18030031/1B6 2D3鼠单抗(PBS,50％甘油)溶液；

标准品：100ng的His-PAT/pat重组蛋白(冻干粉)，所述His-PAT/pat重组蛋白是通过将PAT/pat编码基因进行扩增、测序，鉴定正确以后与pET28a质粒连接，将重组表达载体pET28a-PAT/pat转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，保存的重组蛋白PAT/pat表达菌株复苏培养，用IPTG于16℃过夜诱导表达蛋白，并通过重组蛋白纯化得到；

辣根过氧化物酶标记的亲和素：1:40辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase)标记的亲和素(avidin)母溶液(金开瑞公司)，工作液以1:100倍稀释；

生物素标记的抗体稀释液/辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液配方：

浓缩洗涤液：含有1.0％Tween-20的10×PBS；

底物溶液：0.5mL 2mg/mL TMB无水乙醇溶液，10mL底物缓冲液，32μL 30％H₂O₂混合，现用现配；

终止液：1M H₂SO₄。