[发明专利]一种定量检测抗除草剂蛋白PAT/pat的酶联免疫试剂盒

权利要求书

1.一种定量检测转基因玉米中抗除草剂蛋白PAT/pat的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成；

其中，样品处理液为：1M Tris,pH 7.5 500uL，1M NaCL 1.5mL，0.5M EDTA 20uL，50％甘油2mL，10％SDS 1mL，用双蒸水配成10ML，使用时添加1片蛋白酶抑制剂以及50uL的1mM苯甲基磺酰氟；

生物素标记的检测抗体为100μg/mL生物素标记的PAT/pat单抗杂交瘤细胞株PA1-18030031/1B6 2D3，鼠单抗溶液即PBS,50％甘油；

标准品为100ng的His-PAT/pat重组蛋白；

辣根过氧化物酶标记的亲和素为1:40辣根过氧化物酶标记的亲和素溶液；

生物素标记的抗体稀释液以及辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液配方为1％BSA1g，0.05％的吐温20 0.05mL，0.1％的NaN₃ 0.1mL，最终用1×PBS定容至100mL；

浓缩洗涤液为含有1.0％Tween-20的10×PBS；

底物溶液为0.5mL 2mg/mL TMB无水乙醇溶液，10mL底物缓冲液，32μL30％H₂O₂混合，现用现配；

终止液为1M H₂SO₄。

2.根据权利要求1所述定量检测转基因玉米中抗除草剂蛋白PAT/pat的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的捕获抗体由保藏号为CGMCC No.19948的PAT/pat单抗杂交瘤细胞株PA1-18030031/1F5 2F2分泌得到的，捕获抗体的检测范围1.5625ng/mL-12.5ng/mL。

3.根据权利要求1所述定量检测转基因玉米中抗除草剂蛋白PAT/pat的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述检测抗体由保藏号为CGMCC No.19949的PAT/pat单抗杂交瘤细胞株PA1-18030031/1B6 2D3分泌得到。

4.根据权利要求1所述定量检测转基因玉米中抗除草剂蛋白PAT/pat的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述His-PAT/pat重组蛋白是通过将PAT/pat编码基因进行扩增、测序，鉴定正确以后与pET28a质粒连接，将重组表达载体pET28a-PAT/pat转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，保存的重组蛋白PAT/pat表达菌株复苏培养，用IPTG于16℃过夜诱导表达蛋白，并通过重组蛋白纯化得到。

5.根据权利要求2或3所述定量检测转基因玉米中抗除草剂蛋白PAT/pat的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述PAT/pat单抗杂交瘤细胞株PA1-18030031/1F5 2F2和PAT/pat单抗杂交瘤细胞株PA1-18030031/1B6 2D3是用原核表达的重组蛋白PAT/pat免疫BALB/c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞与商品化的小鼠杂交瘤细胞SP2/0融合，用HAT培养基筛选得到。