[发明专利]一种藻红蛋白(PE)与Annexin V蛋白偶联方法

说明书

本发明公开了一种藻红蛋白(PE)与Annexin V蛋白偶联方法，包括以下步骤：步骤1：Annexin V蛋白表达纯化：1.1：基因序列优化：查找人Annexin V蛋白的基因序列，将人Annexin V基因序列优化，去除终止密码子序列，将其连入原核表达载体pET28a上，保留前后His标签蛋白，为蛋白纯化及后续偶联荧光素纯化做准备；1.2：Annexin V蛋白诱导表达：挑取pET28a‑Annexin V质粒单菌落，接种到10ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜，按照1：100将培养的菌液接种到含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至菌液浓度OD₆₀₀为04‑0.6；本发明先通过分子筛纯化去除大部分游离的PE后再采用镍柱纯化浓缩，得到纯度较高的Annexin V‑PE标记物，且保持蛋白良好的生物活性，可用于细胞凋亡检测。

技术领域

本发明涉及一种藻红蛋白(PE)与Annexin V蛋白偶联方法。

背景技术

细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(Programmed CellDeath，PCD)，是由基因控制的细胞主动的有序性死亡，是生物体调节和维持机体相对平衡的重要方式，与多种疾病病理密切相关。

Annexin V为一种人体内源性蛋白，属于钙离子依赖的磷脂结合蛋白家族，具有抗凝作用，Annexin V共320个氨基酸，包括70-80个氨基酸的重复单元，分子量约36kD，在细胞凋亡过程中，凋亡细胞膜发生变化，PS从细胞膜的脂双层内层迁移至外层是细胞凋亡级联反应的初始事件，Annexin V蛋白与细胞膜上的PS有很高的亲和力，因此利用Annexin V高亲和PS可早期检测凋亡的发生，这是目前公认的灵敏、高效和特异的凋亡细胞检测的方法，Annexin V标记FITC、PE、APC等用于体外细胞凋亡检测。

碘化丙啶(PI)和7-氨基放线菌素(7-AAD)是常用的核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期或死细胞，PI和7-AAD能够透过细胞膜给细胞核染色，因此将AnnexinV与PI或7-AAD结合使用，就可以将不同时期的细胞区分开。

PE与Annexin V蛋白偶联后，偶联后的产物有Annexin V-PE偶联物、游离的PE和Annexin V；目前偶联后混合物纯化方法有分子筛高压液相色谱柱纯化、凝胶过滤层析、离子交换等，分子筛高压液相色谱柱纯化，纯化纯度高，分辨效率高，但是由于只能少量纯化，不能量产，在生产上存在很大的局限性；凝胶过滤层析，即分子筛，按照分子的大小分离蛋白子，由于Annexin V分子量约36kD，PE分子量约240kD，Annexin V-PE偶联物约280kD，PE和Annexin V-PE偶联物分子量差别很小，凝胶过滤层析不能很好的把两者分离开，得到的产物纯度不高；离子交换分离纯化蛋白，是建立在各种生物分子携带有不同的电荷的基础之上分离方法，由于Annexin V、PE和Annexin V-PE偶联物等电点很接近，所以不能用离子交换法分离纯化；在生产中，既要考虑纯化后的纯度，又要考虑纯化的产量。

综上所述，需要一种藻红蛋白(PE)与Annexin V蛋白偶联方法解决现有技术中所存在的不足之处。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种藻红蛋白(PE)与Annexin V蛋白偶联方法，旨在解决上述问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种藻红蛋白(PE)与Annexin V蛋白偶联方法，包括以下步骤：

步骤1：Annexin V蛋白表达纯化：

1.1：基因序列优化：查找人Annexin V蛋白的基因序列，将人Annexin V基因序列优化，去除终止密码子序列，将其连入原核表达载体pET28a上，保留前后His标签蛋白，为蛋白纯化及后续偶联荧光素纯化做准备；